Сложные методы окраски фиксированных препаратов. Методы окраски микробиологических препаратов. Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-

паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата состоит в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Далее препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества˸ спирты, кислоты, ацетон и др.
Размещено на реф.рф
С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять ᴇᴦο после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, в случае если бактериальная пленка (мазок) чересчур толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, в случае если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода . На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).

Сложные

Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие

(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

Окраска по Грамму.

1. Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:

Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).

Предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают

окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

Метод Циля-Нильсона:

Практическое применение : для диагностики заболеваний (туберкулез)

Вопрос 7. Клеточная стенка бактерий: особенности строения у грамположительных и грамотрицательных бактерий, функции, методы выявления. Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. L -формы бактерий.

Ответ:

Клеточная стенка. Располагается над ЦПМ.

КС обеспечивает постоянную форму клетки, механическую и осмотическую защиту, взаимосвязь с окружающей средой, несет рецепторы для бактериофагов.

Отдельные соединения в составе КС обладают целым спектром иммунобиологических свойств : участвуют в адгезии, угнетении фагоцитоза, обладают иммуномодулирующей активностью и т.д.

Химический состав и строение клеточной стенки постоянны и являются важным таксономическим признаком.

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Основа -пептидогликан , обеспечивающий ригидность и эластичность КС.

Структура: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных между собой посредством гликозидных связей.

К каждому остатку N-ацетилмурамовой кислоты присоединен короткий пептид из 4-5 аминокислот.

Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания: наличие аминокислот в D-форме (неприродная конфигурация) и высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Это имеет принципиальное значение для пространственной организации пептидогликана. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.

У грамположительных эубактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90%), у грамотрицательных - содержание пептидогликана значительно меньше (1-10%).

Функции клеточной стенки:

Обусловливает форму клетки.

Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.

Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.

Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.

Особенности строения КС Гр+

Клеточная стенка грамположительных бактерий достаточно плотно прилегает к ЦПМ.

Пептидные сшивки в пептидогликане обеспечивают его трехмерную пространственную организацию.

Многослойный пептидогликан пронизывают тейхоевые кислоты – полифосфатные соединения на основе рибитола или глицерина.

Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой (собственно тейхоевые или стеночные) или с гликолипидом ЦПМ (липотейхоевые).

Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, определяющего поверхностный заряд клетки.

Особенности строения КС Гр-

Пептидогликан образует только тонкий внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегающий к ЦПМ.

У большинства видов пептидогликан образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.

Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (ЛПС).

ЛПС сложного молекулярного строения, занимает около 30-40% поверхности наружной мембраны и является ее важнейшим компонентом.

Методом выявления клеточной стенки является метод Пешкова (КС –красная; цитоплазма –розовая), по Грамму-тип стоения клеточной стенки.

Метод выявления клеточной стенки: Метод Пешкова

Этапы окраски :

1.мазок протравливать в 10% растворе танина 6-8 мин

2.промыть водой

3.окрашивать водным раствором фуксина 30-60 сек

4.высушить

Сущность метода : танин уплотняет клеточную стенку бактерий, и большая часть фуксина задерживается в ней

Цель : выявление клеточной стенки. КС - красная, цитоплазма -розовая

Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена .

L-формы

Если бактерии частично или полностью утратили клеточную стенку, но сохранили способность к размножению, они называются L-формами.

L-формы бактерий образуются под воздействием препаратов, ингибирующих синтез пептидогликана (антибиотик пенициллин) или разрушающих пептидогликан (лизоцим).

Изучают L-формы в фазово-контрастном микроскопе

Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.

Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы(капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса (для окраски чистой культуры капсульных бактерий).

Метод выявления капсул: метод Бурри-Гинса

Цель метода : выявление капсулы у бактерий

Этапы окраски :

1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови

2.высушить и зафиксировать в пламени горелки

3.окрасить карболовым фуксином 1мин

4.высушить

Сущность метода : капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку

Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus

Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.

Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи (один жгутик),перитрихи (жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.

Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F -пили (половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка (адгезия).

Примеры бактерий: Половые пили Е. соli

Salmonella Typhi - перитрихи

Vibrio cholerae - монотрихи

Campylobacter jejuni - лофотрихи или амфитрихи

Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.

Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium . (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму).Высокая резистентность ,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.(на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).

Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.

Функции : участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.

Мезосомы - инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)

Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме

В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция: синтез белков

Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера(окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие ) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые , зерна волютина- темно-синий цвет , расположены на обоих концах клетки) .

Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.

Нуклеоид у прокариот - генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу

Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.

метод Романовского-Гимзы

Цель метода : выявление нуклеоида; нуклеоид - сине-фиолетовый; цитоплазма - розовая

Сущность метода : Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым

Этапы окраски :

1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании

2.промыть водой

3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин

4.высушить

14. Актиномицеты : морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.

Актиномицеты - группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением; гифы переплетаясь, образуют мицелий.

Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание - актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).

В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.

Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена

15. Микоплазмы : таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.

Ответ : Класс - Mollicutes

Порядок - Mycoplasmatales

Семейство - Mycoplasmataceae

Род - Mycoplasma

Микоплазмы - полиморфные микроорганизмы, отличающиеся от других прокариотов отсутствием клеточной стенки

Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, более прочная и эластичная (т.к. в ней присутствует холестерин). Клетки микоплазм содержат нуклеоид(самый маленький), рибосомы, цитоплазму и цпм (без мезосом). У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки (Mycoplasma pneumoniae) и нитчатые выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии.

Для культивирования микоплазм используют специальные полужидкие среды , на которых через 2-4 недели получают видимый рост в виде колоний, напоминающий "яичницу- глазунью"(из-за хрупкости микоплазм - т.к. Отсутствует клеточная стенка).Их изучают в нативных препаратах в фазово-контрастном микроскопе (не удается окрасить из-за хрупкости)

16. Риккетсии : таксономия, биологические свойства, морфологические формы, методы окраски, методы культивирования. Жизненный цикл риккетсий. Роль риккетсий в патологии человека (назовите заболевания и соответствующих им возбудителей).

Ответ : Царство - Bacteria

Порядок - Rickettsiales

Семейство - Rickettsiaceae

Род - Rickettsia

Риккетсии - грамотрицательные полиморфные бактериоподобные прокариоты,капсул,спор не образуют. Облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на простых питательных средах. Жизненный цикл риккетсий включет 2 стадии - вегетативную и покоящуюся . В вегетативной стадии риккетсии активно размножаются путем бинарного деления; покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью(меньших размеров, с утолщенной клеточной стенкой).

Различают 4 морфологические формы риккетсий (по Здродовскому ) :

Кокковидную (d= 0,3-0,4мкм)

Палочкивидную (1-2 мкм)

Бациллярную(3-5 мкм)

Нитевидную(до 40 мкм)

Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков возбудителей инфекций - вшей, блох, клещей. Для окраски риккетсий применяют сложные методы - Романовского-Гимзы и Здродовкого

Методика окраски :

1.фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают разведенным карболовым фуксином Циля(без нагревания)

2.промывают водой

3.обесцвечивают слабым раствором органической 0,5% лимонной к-ты, 0,15% уксусной к-ты или минеральной кислоты (0,01% HCL)

4.промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего

Результат окраски : риккетсии - в рубиново-красный; цитоплазма - голубая; ядро - синее

Патогенные для человека риккетсии являются возбудители риккетсиозов, для которых характерны сыпнотифозные или пятнистые лихорадки. Например, Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический вшивый сыпной тиф.

17. Хламидии : таксономия, морфология и ультраструктура, жизненный цикл. Методы выявления и культивирования. Роль в инфекционной патологии человека.

Ответ : Семейство - Chlamydiaceae

Род - Chlamydia

ЭТ - внеклеточная инфекционная частица (0,2-0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, рибосомы, жесткую клеточную стенку. ЭТ проникает в чувствительную клетку путем эндоцитоза, вокруг него образуется вакуоль. Внутри вакуоли ЭТ разбухает, приобретает сетчатую структуру, увеличивается до 0,5-1,5 мкм и превращается в РТ.

РТ внутри вакуоли многократно делится путем образование поперечных перегородок. Вакуоль заполняется микро-колониями хламидий, содержащих большое количество РТ в процессе деления, промежуточные тельца и ЭТ. Вакуоль превращается во внутриклеточное включение, покрытое оболочкой - хламидой, расположенное в цитоплазме клетки-хозяина. Выход хламидий из клетки - через неповрежденную мембрану или при гибели клетки. Освободившиеся ЭТ внедряются в другие здоровые клетки, где цикл развития повторяется.

Изучают хламидии в живом состоянии, в фазово-контрастном микроскопе и окрашивают методом Романовского-Гимзы (ЭТ - розовые, РТ - сине-голубые).

Патогенны: Chlamydia trachomatis (трахома и урогенитальные инфекции), Chlamydia pneumoniae (респираторные инфекции), Chlamydia psittaci (орнитоз).

18. Спирохеты : таксономия, биологические свойства, ультраструктура клетки, цисты. Методы изучения спирохет нативных и окрашенных препаратов. Роль спирохет в инфекционной патологии человека.

Семейство – Spirochaetaceae

Спирохеты - тонкие нитевидные, спирально извитые микроорганизмы, обладающие активной подвижностью. Относятся к грамотрицательным прокариотам. Клеточная стенка эластичная, что позволяет им совершать колебательные, вращательные и сгибательные движения.

Двигательный аппарат представляет собой фибриллярный тяж, состоящий из 2х пучков фибрилл, расположенных субтерминально на обоих концах клетки. Фибриллы пролегают в клеточной стенке, обвивая цитоплазматический цилиндр (протопласт). В середине клетки фибриллы перекрывают друг друга. Фибриллы состоят из белка флагеллина.

Спирохеты изучают в нативных препаратах, используя темно-польную микроскопию для выявления их форм и подвижности. Их Ультраструктуру изучают с помощью электронной микроскопии. Для изучения спирохет в окрашенном состоянии применяют: метод Романовского-Гимзы (боррелии в сине-фиолетовый, трепонемы в бледно-розовый, лептоспиры в красно-розовый), метод серебрения по Морозову (спирохеты имеют вид тесно-коричневых спиралей на светло-желтом фоне препарате),негативный способ Бурри (тушь не проникает тела микробов,на темном фоне белые контуры спирохет)

существенную роль в инфекционной патологии человека играют роды Treponema, Borrelia и Leptospira. Treponema pallidum - возбудитель сифилиса, Borrelia recurrentis - возбудитель возвратного тифа, Leptospira interrogans является возбудителем лептоспироза

19. Микроскопические грибы : морфология, ультраструктура. Размножение плесневых и дрожжевых грибов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.

Протопласты (содержимое клетки, заключенное в клеточную стенку) клетки грибов содержат ядро с ядрышком, митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, фагосомы, вакуоли и др. Снаружи протопласты покрыты ЦПМ с высоким содержанием стеролов (главным образом эргостерола) и плотной клеточной стенкой,в состав которой входят хитин, целлюлоза, глюкуроновая кислота, глюканы, различные углеводы, липиды, белки, пигменты.

По морфологическим особенностям грибы подразделяются на группы: плесневые грибы и дрожжеподобные грибы

Плесневые грибы образуют мицелий (тело гриба), который состоит из переплетенных гифов. На питательной среде плесневые грибы образуют субстратный мицелий, который прорастает в нее, извлекая из среды все необходимые для роста и размножения вещества, и воздушный мицелий,на котором созревают неполовые споры,с помощью которых грибы размножаются. Бесполовой путь у плесневых грибов характеризуется образованием большого количества экзоспор или эндоспор. Многие грибы могут размножаться и половыми спорами(половым путем).

Дрожжевые грибы размножаются почкованием.

Морфологию грибов изучают в нативных препаратах "раздавленная капля" в затемненном поле зрения, фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе и с помощью окраски простым методом, по Граму, Цилю-Нильсену,Нейссеру

Заболевания вызываемые микроскопическими грибами - микозы.Грибковое заболевание Кандидоз - вызывается Candida albicans

РАЗДЕЛ ФИЗИОЛОГИЯ.

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

Кокки (за исключением гонококков и менингококков);

Бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

Микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

Некоторые кокки (гонококки и менингококки);

Все остальные палочковидные бактерии;

Все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

Защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

Определение формы бактерий;

Участие в метаболизме бактерий;

Токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

Наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма ) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана ) состоит из липополисахарида , белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами . У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко­личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

Барьерная функция (молекулярное “сито”);

Избирательный перенос раз­личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

Превращение клеточ­ной энергии;

Репликация и последующее разделение хро­мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом . По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе­ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы­ваемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.

Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула - это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

Место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

Защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

Способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспо­ры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

Центральное (возбудитель сибирской язвы);

Субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);

Терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

При простых методах окраски используется лишь одна краска.

С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола.
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Окраска бактерий по по Цилю-Нильсену

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

Окраска по по Ауески

Метод окраски спор бактерий, заключающийся в обработке препарата горячим 0,5% раствором соляной кислоты с последующей фиксацией и окраской по способу Циля - Нельсена; споры окрашиваются в рубиново-красный цвет, вегетативные формы - в синий.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.

2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.

3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).

4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.

5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.

6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.

7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

12. Окраска по Граму, техника, назначение. Отличие грам- и грам+ бактерий.

Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.

По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.

Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет. Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Отличие грам+ и грам- бактерий

У грамположительных бактерий клеточные стенки содержат мало липидов, а у грамотрицательных клеточные стенки, напротив богаты липидами. И у тех и у других жесткий каркас образуется в результате ковалентного связывания полисахаридных и пептидных цепей. Однако, к этой структурной основе присоединяются некоторые специфические для данной бактерии компоненты, которые у грамположительных и грамотрицательных бактерий имеют разный состав.

Стенки бактериальных клеток содержат еще и некоторые сопутствующие компоненты, которые у разных бактерий варьируются. У грамположительных бактерий это тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды или белки. У грамотрицательных бактерий больше сопутствующих компонентов, вплетенных в муреиновую сеть. Это полипептиды, липопротеины, сложные липополисахариды. Все эти компоненты наделяют клетки грамотрицательных бактерий сложной антигенной специфичностью, а также акцепторной специфичностью по отношению к вирусам.

Таким образом, клеточная стенка грамположительной бактерии представляет собой жесткий хрупкий корпус бактерии, а клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют мягкое покрытие, богатое липидами и укрывающее лежащий под ними муреиновый скелет.