Каква е основата на действието на реакцията на аглутинация. Реакция на аглутинация (РА), механизъм и методи на поставяне. Съставки и как да ги получите. Използването на RA в диагностиката на инфекциозни заболявания. Имунна електронна микроскопия

Реакция на аглутинация

Аглутинация (лат. аглутинация- слепване) - слепване (свързване) на антиген-носещи корпускулярни частици (цели клетки, латексни частици и др.) с молекули на специфични антитела в присъствието на електролити, което завършва с образуването на люспи или утайка (аглутинат), видими за просто око. Естеството на утайката зависи от естеството на антигена: флагеларните бактерии дават утайка с големи люспи, флагеларни и безкапсулни - финозърнести, капсулни - нишковидни. Разграничете директната аглутинация, при която взаимодействието със специфични антитела директно включва собствени антигени на бактериална или друга клетка, като еритроцити; и индиректни или пасивни, при които бактериални клетки или еритроцити, или частици от латекс са носители не на собствените си, а на чужди антигени (или антитела), адсорбирани върху тях, за да открият антитела (или антигени), специфични за тях. Реакцията на аглутинация включва главно антитела, принадлежащи към класовете IgG и IgM. Протича в две фази: първо, има специфично взаимодействие на активния център на антителата с антигенната детерминанта, този етап може да възникне при липса на електролити и не е придружен от видими промени в реагиращата система. Вторият етап, образуването на аглутинат, изисква наличието на електролити, които намаляват електрическия заряд на комплексите антиген + антитяло и ускоряват процеса на тяхното слепване. Тази фаза завършва с образуването на аглутинат.

Реакциите за аглутинация се поставят върху стъклени или гладки картонени плочи или в стерилни епруветки за аглутинация. Реакциите на аглутинация (директни и пасивни) върху стъкло обикновено се използват като ускорен метод за откриване на специфични антитела в серума на пациента (например при бруцелоза) или за серологична идентификация на патогена. В последния случай обикновено се използват добре пречистени (адсорбирани) диагностични серуми, съдържащи само монорецепторни антитела или техния набор от различни антигени. Безспорното предимство на реакцията на аглутинация върху стъкло е простотата на нейната формулировка и факта, че отнема няколко минути или дори секунди, тъй като и двата компонента се използват в нея в концентрирана форма. Той обаче има само качествена стойност и е по-малко чувствителен от епруветката. Разширеният тест за аглутинация в епруветки дава по-точни резултати, тъй като ви позволява да определите количественото съдържание на антитела в серума (задайте неговия титър) и, ако е необходимо, да регистрирате факта на повишаване на титъра на антителата, което има диагностична стойност. За да се установи реакцията, серумът, разреден с 0,85% разтвор на NaCl по определен начин, и равен обем (обикновено 0,5 ml) суспензия от стандартен диагностикум (или тестова култура), съдържаща 1 милиард бактерии в 1 ml, се въвеждат в аглутинацията. тръби. Отчитането на резултатите от реакцията на аглутинация се извършва предварително след 2 часа инкубация на епруветките при температура 37 ° C и накрая след 20-24 часа според два признака: наличието и размера на утайката и степента на прозрачност на супернатанта. Оценяването се извършва по четирикратната система. Реакцията задължително се придружава от контрол на серум и антиген. В случаите, когато се използва подробен тест за аглутинация в епруветка за серологична идентификация на патогена, той има диагностична стойност, ако реакцията се оцени като положителна, когато диагностичният серум е разреден с най-малко половината от неговия титър.

Трябва да се има предвид, че при смесване на разтвори на хомоложни антигени и антитела не винаги се наблюдават видими прояви на реакцията на аглутинация. Утайка се образува само при определени оптимални съотношения на двата компонента на реакцията. Извън тези граници, при значителен излишък на антиген или антитела, не се наблюдава реакция. Това явление се нарича "прозонов феномен". Наблюдава се както при реакцията на аглутинация, така и при реакцията на утаяване. Появата на прозон в имунните реакции се обяснява с факта, че участващите в тях антигени по правило са полидетерминантни, а молекулите IgG антителаимат два активни центъра. При излишък от антитела повърхността на всяка антигенна частица е покрита с молекули на антитела, така че не остават свободни детерминантни групи, така че вторият, несвързан активен център на антителата не може да взаимодейства с друга антигенна частица и да ги свърже един с друг. Образуването на видим аглутинат или преципитат също се потиска с излишък на антиген, когато няма нито едно свободно активно място на антитела и следователно комплексите антиген + антитяло + антиген вече не могат да бъдат увеличени.

в микробиологията

"Реакция на аглутинация и нейните видове (RA)"

план:

1. Въведение………………………………………………………………………………………..3

2. RA върху стъкло……………………………………………………………………………………….4

3. Епруветка PA………………………………………………………………………………….5

4. Използвана литература………………………………………………………………………..7

1. Въведение.

Взаимодействието на микробния антиген и антитела е строго специфично и е насочено в животинския организъм за неутрализиране на патогена и неговите токсини. Взаимодействието на антиген и антитела in vitro при определени условия е придружено от видими явления (аглутинация, утаяване, имунен лизис), което позволява използването на AG-AT реакции, наречени серологични (от латински serum-серум), за практически цели. Биофабриките произвеждат антигени и имунни серуми (антитела) с известна специфична посока (диагностика). С помощта на такива серуми при серологични реакции е възможно да се идентифицира неизвестен микроорганизъм или, като се използва известен антиген, да се открият антитела в тялото, синтезирани в отговор на въвеждането на патоген, и по този начин да се постави диагноза (серологична диагноза) . В допълнение, серологичните реакции могат да се използват за оценка на интензивността на имунния отговор след ваксинация или инфекциозно заболяване.

Реакциите на аглутинация, като непряка аглутинация и Coombs, се основават на in vitro взаимодействието на корпускулните антигени с антителата и способността на получените комплекси да се утаяват. Като корпускулярни антигени се използват бактериални клетки или разтворими антигени, извлечени от микроорганизми и адсорбирани върху корпускули на носители: еритроцити, латексни частици и др.

Антигенните детерминанти на корпускулярните антигени специфично взаимодействат с хомоложни антитела (специфична, невидима фаза на реакцията), след което комплексите антиген-антитяло образуват големи, видими с просто око конгломерати, които се утаяват - аглутинират (неспецифична, видима фаза на реакцията) . В нефлагелирани форми на микроби (Brucella) се образуват гранулирани аглутинанти, в камшичета (Escherichia, Salmonella) - голям памук, който се утаява на дъното на епруветката под формата на обърнат чадър и лесно се чупи при разклащане . Антигените и антителата взаимодействат само в присъствието на електролит (в 0,8% разтвор на натриев хлорид). Ходът на реакцията се влияе от концентрацията на сол в електролита, броя на микробните клетки в суспензията, серумната концентрация, pH, температурата и други фактори.

Реакция на аглутинация (ra).

Разграничете специфичната аглутинация, роят се основава на взаимодействието на антигена схомоложно антитяло , съдържащ се в тялото на животното, Krom е въведен този антиген (имуноаглутинация); неспецифични (химични), произтичащи от промени в pH на околната среда, концентрацията на електролити; спонтанен, to-ruyu се наблюдава, когато бактериите (които са в R-форма) се суспендират във физиологичен разтвор и при нагряване, което е свързано с промяна в колоидното състояние на бактериалната клетка. Антиген , участващи в RA се нарича аглутиноген, антитялото се нарича аглутинин, получената утайка се нарича аглутинат. При образуването на аглутинат има значение количественото съотношение на антигена и антителата (оптимално явление). При излишък или дефицит на антитела, A.

Реакцията на аглутинация (РА) е една от първите имунологични реакции, които се използват в микробиологичната практика. За първи път (1895) F. Vidal използва RA за диагностика на коремен тиф. По-късно (1897 г.) А. Райт използва същата реакция за диагностициране на бруцелоза при хора. РА е намерил приложение и в диагностиката на пулороза на пилета, лептоспироза, инфекциозен аборт на кобили, както и за типизиране на неизвестни култури от микроби според известен аглутиниращ серум. RA е силно чувствителен; той може да открие 0,01 µg азотен протеин на антитяло в 1 ml.

Разработени са няколко варианта на реакцията на аглутинация, които се различават по методологично изпълнение и цел на изследването.

2. Ра върху стъкло.

При този вариант на РА могат да се изследват както серум, така и антиген, но този вариант най-често се използва за идентифициране на микроорганизми.

1. За идентифициране на микроорганизма (m / o), капка от известен аглутиниращ серум, като салмонелиоза, и капка физиологичен разтвор (контрола) се прилагат отделно върху обезмаслено стъкло. След това, използвайки бактериологична примка, бактериалната маса на изследваната култура се взема от колонията в петриево блюдо или от повърхността на наклонената МРА в епруветка и се суспендира отделно в имунен серум и физиологичен разтвор, докато се получи хомогенна суспензия . Резултатът се взема предвид след 2 ... 4 минути.

Отчитане на резултатите: не трябва да има промяна в контролната проба. При специфично съответствие на бактериалната култура с имунния серум се появяват люспи от аглутинат (положителен резултат), при липса на феномен на аглутинация се заключава, че изследваната бактериална култура не съответства на имунния серум.

2. Откриването на антитела в изследвания кръвен серум ще бъде разгледано с помощта на примера на розово-бенгалския тест, използван при серодиагностиката на бруцелоза. 0,3 ml от изследвания животински кръвен серум и 0,03 ml бруцелален антиген (бруцелни клетки, оцветени с розов бенгал) се нанасят върху предметно стъкло. Компонентите се смесват старателно чрез разклащане на чашата и резултатът се отчита след 4 минути.

Счетоводни резултати: при положителна реакция се появяват розови люспи от аглутинат. Серологична реакция от този тип се класифицира като качествена, тъй като може да се използва за откриване на антитела срещу патогена в кръвния серум на животното, но е невъзможно да се оцени тяхното количествено съдържание.

Реакцията на аглутинация (RA) е адхезия и утаяване на микроби или други клетки под действието на антитела в присъствието на електролит. Получената утайка се нарича аглутинат.

RA се използва:

1. За откриване на антитела в кръвния серум на пациента (серодиагностика).

2. Определяне на вида и серовар на чиста култура от патогенни микроорганизми, изолирани от пациент (серотипиране).

Реакцията на аглутинация се използва за определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с коремен тиф и паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакции на Райт, Хъдълсън), туларемия, лептоспироза и други инфекциозни заболявания, както и за определяне на патогенът, изолиран от пациента (чревни инфекции, магарешка кашлица и др.). RA се използва за определяне на кръвни групи, Rh фактор и др.

Реакцията изисква следните компоненти:

1. Антигенът (аглутиноген) трябва да бъде корпускуларен, т.е. това е суспензия от живи или убити микроорганизми (диагноза m), еритроцити или други клетки. Обикновено се използва ежедневна култура от микроорганизми, отглеждани върху наклонен агар. Културата се отмива с 3-4 ml изотоничен разтвор, прехвърля се в стерилна епруветка и се определя плътността. Суспензията трябва да бъде хомогенна и да съдържа до 3 милиарда микробни клетки на 1 ml. Използването на суспензия от убити микроби - диагностикуми - улеснява работата (приготвена фабрично).

2. Антитела (аглутинини) се откриват в серума на пациента (със серодиагностика) или в аглутиниращ серум (със серотипиране). Аглутиниращите серуми се получават чрез имунизиране на зайци с убити бактерии.

Титър аглутиниращсерум се нарича неговото най-високо разреждане, при което той не реагира със съответния антиген при определени експериментални условия.

Аглутиниращите серуми могат да бъдат нативни (неадсорбирани) и адсорбирани. Нативните серуми в малки разреждания взаимодействат не само с типа микроорганизми, с които животното е имунизирано за получаване на серум, но също и със сродни видове микроорганизми, тъй като съдържат групови антитела (антитела срещу микроорганизми, които имат общи антигени). Нативните серуми се използват за разширена реакция на аглутинация (със серодиагностика), която отчита не само наличието на реакцията, но и динамиката на повишаване на титъра на антителата.

Ако групови антитела се екстрахират (адсорбират) от нативен серум чрез взаимодействие със сродни бактерии, които имат групови антигени, се получават адсорбирани серуми. Адсорбираните серуми могат да бъдат монорецепторни (или тип-специфични), съдържащи антитела само към един антигенен рецептор.Поливалентните серуми се състоят от смес от няколко адсорбирани или неадсорбирани серуми. Адсорбираните серуми се използват за реакцията на аглутинация върху стъкло.

Когато животните се имунизират с подвижни бактерии с Н-антиген, се получават Н-аглутиниращи серуми, съдържащи Н-антитела (например Salmonella monoreceptor H-аглутиниращ серум). О-антигенната имунизация произвежда О-аглутиниращи серуми, съдържащи О-антитела (например О-аглутиниращ серум, адсорбиран от салмонелна група, антихолерен О-аглутиниращ серум). Имунизацията с Н- и О-антигени произвежда серуми с Н- и О-антитела.

Освен това О-аглутинините дават финозърнест аглутинат, а Н-аглутинините дават едрозърнеста утайка.

3. Електролит - изотоничен разтвор на NaCl (0,9% разтвор на натриев хлорид, приготвен с дестилирана вода).

Има два основни метода за създаване на реакция на аглутинация: реакция върху стъкло (понякога наричана индикативна или ламеларна) и разширена реакция (в епруветки).

Изявление на реакцията на аглутинация върху стъкло. Две капки серум и капка изотоничен разтвор на натриев хлорид се нанасят върху обезмаслено предметно стъкло. Диагностичният аглутиниращ серум се взема в едно разреждане, което в зависимост от неговия титър е 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100. В една от капките серум и капка изотоничен разтвор се въвежда култура от изследвания микроорганизъм с бримка и се смесва добре. Капка натриев хлорид с микроорганизми е антигенна контрола, капка серум без микроорганизми е серумна контрола. Не прехвърляйте културата от капката серум в капката NaCl. Реакцията протича при стайна температура за 1-3 минути. Ако серумната контрола остане бистра, се наблюдава равномерна мътност в антигенната контрола и се появяват аглутинирани люспи в капката, където културата се смесва със серум, тогава резултатът се счита за положителен. Ако има равномерна мътност в капка със серум и антиген, тогава това е отрицателен резултат. Реакцията е по-ясно видима на тъмен фон.

Серум

1. антигенен контрол

2. серумен контрол

имунодиагностични реакции. Реакции антиген-антитяло и реакции с белязани компоненти. Използва се за идентифициране на микроорганизми и диагностични цели инфекциозни заболявания.

Имунните реакции се използват при диагностични и имунологични изследвания при пациенти и здрави хора. За целта нанесете серологични методи(от лат. серум - серум и лога - доктрина), т.е. методи за изследване на антитела и антигени, като се използват реакции антиген-антитяло, определени в кръвен серум и други течности, както и телесни тъкани.

Откриването на антитела срещу антигените на патогена в кръвния серум на пациента прави възможно диагностицирането на заболяването. Серологичните изследвания се използват и за идентифициране на микробни антигени, различни биологично активни вещества, кръвни групи, тъканни и туморни антигени, имунни комплекси, клетъчни рецептори и др.

Когато микроб се изолира от пациент, патогенът се идентифицира чрез изследване на неговите антигенни свойства с помощта на имунни диагностични серуми, т.е. кръвни серуми на хиперимунизирани животни, съдържащи специфични антитела. Този т.нар серологична идентификациямикроорганизми.

В микробиологията и имунологията широко се използват реакции на аглутинация, преципитация, неутрализация, реакции с участието на комплемент, с използване на белязани антитела и антигени (радиоимунологични, ензимни имуноанализа, имунофлуоресцентни методи). Изброените реакции се различават по регистрирания ефект и техниката на настройка, но всички те са основни. ванове върху реакцията на взаимодействие на антиген с антитяло и се използват за откриване както на антитела, така и на антигени. Реакциите на имунитета се характеризират с висока чувствителност и специфичност.

Принципите и схемите на основните имунодиагностични реакции са дадени по-долу. Дадена е подробна техника за настройка на реакциите. практически насоки за имунодиагностика.

Реакция на аглутинация - РА(от лат. аглути- нация- свързване) - проста реакция, при която антителата свързват корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна, индиректна и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка

RA се използва за:

определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;

определяне на патогена, изолиран от пациента;

определяне на кръвни групи с помощта на моноклонални антитела срещу еритроцитни алогени.

За определяне на антителата на пациента слагамудължена реакция на аглутинация:добавете към разрежданията на кръвния серум на пациента диагностикум(суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 ° C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което настъпва аглутинация, т.е. образува се утайка.

Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това е взаимодействието на диагностикуми (О- и R-антигени) със специфични антитела. Реакция на аглутинация с О-диагностикум(бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилен О антиген)протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.

Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете ориентировъчна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Приблизителна реакция се провежда върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум в разреждане 1:10 или 1:20 се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, те поставят обширна реакция на аглутинацияв епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към които се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.

Различни свързани бактерии могат да бъдат аглутинирани от един и същ диагностичен аглутиниращ серум, което затруднява идентифицирането им. Затова се наслаждавайте адсорбирани аглутиниращи серуми,от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия. Приготвянето на монорецепторни диагностични аглутиниращи серуми по този начин е предложено от A. Castellani (1902).

Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация (RNHA, RPHA) се основава на използването на еритроцити с антигени или антитела, адсорбирани на повърхността, взаимодействието на които със съответните антитела или антигени на кръвния серум на топката кара еритроцитите да се слепват и да падат на дъното на топката. епруветката или клетката Vпод формата на назъбена утайка (фиг. 13.2). При обратна реакцияеритроцитите се установяват под формата на "копче". Обикновено антителата се откриват в RNHA с помощта на антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити с адсорбирана Натехни антигени. Понякога използваме антитяло еритроцитна диагностика, върху която се адсорбират антитела. Например, ботулиновият токсин може да бъде открит чрез добавяне на еритроцитно антитяло botulinum diagnosticum към него (тази реакция се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация- РОНГА). RNHA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания, определяне на гонадотропен хормон Vурина по време на установяване на бременност, за откриване на свръхчувствителност към лекарства, хормони и в някои други случаи.

Реакция на коаглутинация . Патогенните клетки се определят с помощта на стафилококи, предварително обработени с имунен диагностичен серум. Протеин, съдържащ стафилококи а,имащи афинитет къмФК -фрагмент от имуноглобулини, неспецифично адсорбира антимикробни антитела, които след това взаимодействат с активни центрове със съответните микроби, изолирани от пациенти. В резултат на коаглутинацията се образуват люспи, състоящи се от стафилококи, диагностични серумни антитела и определяния микроб.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на антигени на вируси от антитела на имунен серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки (фиг. 13.3). RTHA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.

Реакция на аглутинация за определяне на кръвни групи използва се за установяване на системата ABO (вижте раздел 10.1.4.1), като се използва аглутинация на еритроцити с антитела от имунен серум срещу антигени на кръвни групи A (II), B (III). Контролите са: серум без антитела, т.е AB (GU)кръвни групи; антигени, съдържащи се в еритроцитите от групи A (II), B (III). Отрицателната контрола не съдържа антигени, т.е. използвани са еритроцити от група 0 (I).

IN реакции на аглутинация за определяне на Rh фактора(вижте раздел 10.1.4.1) използвайте анти-Rh серуми (поне две различни серии). При наличие на Rh антиген върху мембраната на изследваните еритроцити настъпва аглутинация на тези клетки. Като контроли служат стандартните Rh-положителни и Rh-отрицателни еритроцити от всички кръвни групи.

Реакция на аглутинация за определяне на анти-резус антитела ( индиректна реакцияКумбс)използвани при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват антирезус антитела, които са непълни, едновалентни. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Наличието на такива непълни антитела се определя в индиректната реакция на Coombs. За да направите това, към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което предизвиква аглутинация на еритроцитите (фиг. 13.4). С помощта на реакцията на Кумбс се диагностицират патологични състояния, свързани с вътресъдов лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото: еритроцитите на Rh-положителен плод се комбинират с непълни антитела срещу Rh фактора, циркулиращ в кръвта, който преминава плацентата от Rh-отрицателна майка.

Реакции на утаяване

реакция на утаяване - RP (отлат. praeci-pito- преципитат,) е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, т.нар. утайка.Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунния комплекс.

Реакции на утаяване, поставени в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване),в гелове, хранителни среди и др. Разновидностите на реакцията на утаяване в полутечен гел от агар или агароза са широко използвани: двойна имунодифузия по Ouchterlony. радиална имунодифузия, имуноелектрофорезаи т.н.

Реакция на пръстеновидно утаяване . Реакцията се провежда в тесни утаителни епруветки с имунен серум, върху който е наслоен разтворим антиген. При оптимално съотношение на антиген и антитела на границата на тези два разтвора се образува непрозрачен преципитатен пръстен (фиг. 13.5). Излишъкът от антиген не влияе върху резултата от реакцията на утаяване на пръстена поради постепенната дифузия на реагентите към границата на течността. Ако сварени и филтрирани водни екстракти от органи или тъкани се използват като антигени в реакцията на пръстеновидно утаяване, тогава такава реакция се нарича реакция на термоутаяване-iii (реакция на Асколи,с антракс /

Реакция на двойна имунодифузия на Oukhteruni . За да се настрои реакцията, разтопеният агар гел се излива на тънък слой върху стъклена плоча и след като се втвърди, в него се изрязват отвори с размери 2-3 mm. Антигените и имунните серуми се поставят отделно в тези ямки, които дифундират една към друга. В точката на среща в еквивалентни пропорции те образуват утайка под формата на бяла лента. В многокомпонентни системи се появяват няколко линии от утайка между ямките с различни антигени и серумни антитела; за идентични антигени линиите на утайката се сливат; за нееднакви се пресичат (фиг. 13.6).

Реакция на радиална имунодифузия . Имунният серум с разтопен агар гел се излива равномерно върху стъклото. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът в различни разреждания. Антигенът, дифундирайки в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антителата (фиг. 13.7). Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена. Реакцията се използва за определяне на кръвните нива на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.

Имуноелектрофореза- комбинация от метода на електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза. След това, успоредно на зоните на електрофореза, в жлеба се въвежда имунен серум, чиито антитела, дифундирайки в гела, се образуват в точката на среща с антигена на линията на утаяване.

реакция на флокулация(според Рамон) (от лат. флокус-вълнени люспи) - появата на опалесценция или флокулентна маса (имунопреципитация) в епруветка по време на реакция токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Използва се за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид.

Имунна електронна микроскопия- електронна микроскопия на микроби, по-често вируси, третирани с подходящи антитела. Вирусите, третирани с имунен серум, образуват имунни агрегати (микропреципитати). Около вирионите се образува "венче" от антитела, контрастирани с фосфорволфрамова киселина или други електронно-оптически плътни препарати.

Реакции, включващи комплемент

Реакции, включващи комплементвъз основа на активирането на комплемента от комплекс антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).

Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) се крие във факта, че когато съответстват един на друг, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който чрезФК -фрагмент от антитела се присъединява към комплемента (С), т.е. свързването на комплемента става с комплекс антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не отговарят едно на друго (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).

Реакцията на радиална хемолиза (RRH ) поставени в ямки от агар гел, съдържащ еритроцити от овен и комплемент. След добавяне на хемолитичен серум (антитела срещу еритроцити на коч) към ямките на гела, около тях се образува зона на хемолиза (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към ямките на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусните антигени, адсорбирани върху еритроцитите след това

Компонентите на комплемента се прикрепят към този комплекс, причинявайки хемолиза.

Реакция на имунна адхезия (RIP ) се основава на активирането на системата на комплемента от корпускулярни антигени (бактерии, вируси), третирани с имунен серум. В резултат на това се образува активиран трети компонент на комплемента (C3b), който се прикрепя към корпускуларния антиген като част от имунния комплекс. На еритроцитите, тромбоцитите, макрофагите има рецептори за C3b, поради което, когато тези клетки се смесват с имунни комплекси, носещи C3b, те се комбинират и аглутинират.

Реакция на неутрализация

Имунните серумни антитела са в състояние да неутрализират увреждащото действие на микробите или техните токсини върху чувствителни клетки и тъкани, което е свързано с блокадата на микробните антигени от антитела, т.е. неутрализиране. Реакция на неутрализация(RN) се извършва чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). При липса на увреждащ ефект на микроорганизми или техните антигени, токсини при животни и тестови обекти, те говорят за неутрализиращия ефект на имунния серум и следователно за специфичността на взаимодействието на комплекса антиген-антитяло (фиг. 13.9).

Имунофлуоресцентна реакция - RIF (метод на Кунс)

Има три основни разновидности на метода: директен, косвен (фиг. 13.10), с допълнение. Реакцията на Кунс е бърз диагностичен метод за откриване на микробни антигени или откриване на антитела.

Директен RIF метод се основава на факта, че тъканни антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп.

Бактериите в намазка, обработени с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.

Индиректен RIF метод е да се идентифицира комплексът антиген-антитяло, като се използва антиглобулинов (анти-антитяло) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробни антигени, се отмиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на намазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, белязан с флуорохроми. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + анти-заешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцентен микроскоп, както при директния метод.

ELISA метод или анализ (ELISA)

ELISA -откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с маркиращ ензим (пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза или алкална фосфатаза). След като антигенът се комбинира с ензимно белязаните имунни серуми, субстратът/хромогенът се добавя към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и цветът на реакционния продукт се променя - интензитетът на цвета е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърда фаза ELISA - най-често срещаният вариант на имунологичния тест, когато един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямките на полистиролови плаки

При определяне на антитела кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, маркиран с ензима, и субстратът (хромоген) за ензима се добавят последователно към ямките на плаките с адсорбирания антиген.

Всеки път след добавянето на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. При положителен резултатцветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитела. След това желаният антиген се въвежда в ямките с адсорбирани антитела, добавя се имунният серум срещу антигена, маркиран с ензима, и след това се добавя субстратът за ензима.

Конкурентна ELISA . целевият антиген и белязаният с ензим антиген се конкурират един с друг за свързването на ограничено количество имунни серумни антитела. Друг тест са антителата, които търсите

и белязаните антитела се конкурират помежду си за антигени.

Радиоимунологичен метод или анализ (RIA)

Високочувствителен метод, базиран на реакцията антиген-антитяло, използваща антигени или антитела, маркирани с радионуклид (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr и др.). След тяхното взаимодействие, полученият радиоактивен имунен комплекс се отделя и неговата радиоактивност се определя в съответния брояч (бета или гама лъчение):

интензивността на радиацията е право пропорционална на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

При твърдофазна версия на RIA един от реакционните компоненти (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямки от полистиренови микрочипове. Друга версия на метода е конкурентен RIA.целевият антиген и белязаният с радионуклид антиген се конкурират помежду си за свързване на ограничено количество имунни серумни антитела. Тази опция се използва за определяне на количеството антиген в тестовия материал.

RIA се използва за откриване на микробни антигени, определяне на хормони, ензими, лекарствени веществаи имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в незначителни концентрации - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Методът представлява определена опасност за околната среда.

Имуноблотинг

Имуноблотинг (IB)- високочувствителен метод, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA.

Антигенът се изолира с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел, след което се прехвърля (блотинг - от англ. петно, петно) от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и проявено чрез ELISA. Фирмите произвеждат такива ленти с "петна"

антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. След това, след инкубация, пациентът се измива от несвързаните антитела на пациента и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязан с ензим. Комплексът антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig, образуван върху лентата, се открива чрез добавяне на субстрат / хромоген, който променя цвета си под действието на ензима (фиг. 13.12).

IB се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

Аглутинацията е аглутинация и утаяване на микроби или други клетки под действието на антитела в присъствието на електролит (изотоничен разтвор на натриев хлорид).Групи от лепкави бактерии (клетки) се наричат ​​аглутинати. За реакцията на аглутинация са необходими следните компоненти:

1. Антитела (аглутинини), които са в серума на болно или имунизирано животно.

2. Антиген - суспензия от живи или убити микроби, еритроцити или други клетки.

3. Изотоничен (0,9%) разтвор на натриев хлорид.

Реакцията на аглутинация за серодиагностика се използва за коремен тиф и паратиф (реакция на Видал), за бруцелоза (реакция на Райт и Хъдълсън), туларемия и др. В този случай серумът на пациента е антитялото, а известният микроб е антигенът. Когато се идентифицират микроби или други клетки, тяхната суспензия служи като антиген, а известен имунен серум служи като антитяло. Тази реакция се използва широко за диагностика чревни инфекции, магарешка кашлица и др.

Методи за стадиране на РА

Приблизителна RA върху стъкло

Разположен RA

(обемен метод)

Реакция на коаглутинация

Разширен RA върху стъкло (сероидидентификация)

Реакция на аглутинация върху стъкло.Две капки специфичен (адсорбиран) серум и капка изотоничен разтвор на натриев хлорид се нанасят върху обезмаслено предметно стъкло. Неадсорбираните серуми се разреждат предварително в съотношение 1:5 - 1:100. Капките върху стъкло трябва да се нанасят така, че да има разстояние между тях. Културата се разтрива старателно с примка или пипета върху чаша и след това се добавя към капка изотоничен разтвор на натриев хлорид и една от капките серум, като се разбърква всяка, докато се образува хомогенна суспензия. Серумната капка без култура е серумната контрола.

внимание!Серумната култура не трябва да се прехвърля в капка изотоничен разтвор на натриев хлорид, който е антигенна контрола. Реакцията протича при стайна температура за 1-3 минути. Ако серумната контрола остане прозрачна, се наблюдава равномерна мътност в антигенната контрола и се появяват люспи от аглутинат на фона на бистра течност в капката, където културата се смесва със серум, резултатът от реакцията се счита за положителен.

Диагностична физиологична

серум + културален разтвор + култура

Разширена реакция на аглутинация (обемен метод).Серумните разреждания се приготвят в последователни, най-често двукратни разреждания. Методът се нарича насипно. За да определите титъра на антителата в кръвния серум, вземете 6 епруветки. Изсипете 1 ml от първоначалното разреждане на серума 1:50 в първата епруветка и добавете 1 ml физиологичен разтвор към всичките 6 епруветки с градуирана пипета. В първата епруветка ще се получи разреждане на серум 1:100 с обем 2 ml. От първата епруветка прехвърлете 1 ml във втората епруветка, където разреждането става 1:200. Затова направете серия от серийни разреждания на серума в първите 5 епруветки (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Изсипете 1 ml от петата епруветка в дезинфектантния разтвор. Добавете 2 капки диагностикум към всичките 6 епруветки. Шестата епруветка е контролна култура, тъй като съдържа само физиологичен разтвор и диагностикум.

Такъв контрол е необходим, за да се изключи спонтанна културна аглутинация. Епруветките се разклащат и се поставят в термостат при температура 37°С за 2 часа, след което се оставят за един ден при стайна температура, след което се записват резултатите от реакцията на аглутинация. При установяване на реакция на аглутинация със серуми на деца през първите месеци от живота, поради функционалната непълноценност на образуването на антитела, е необходимо да се идентифицират по-ниски титри на антитела, което се взема предвид при разреждане на серума. Първоначалното разреждане на серума е 1:25. В първата епруветка се получава разреждане 1:50, след това 1:100 и т.н.

При положителен резултат от реакцията в епруветките на фона на бистра течност се виждат лепкави клетки под формата на зърна или люспи.Аглутинатът постепенно се утаява на дъното под формата на "чадър", а течността над утайката става бистра. Антигенната контрола е равномерно мътна.

По естеството на утайката се разграничават финозърнеста и едрозърнеста (подобна на люспи) аглутинация. При работа с О-серуми се получава финозърнеста аглутинация. Едрозърнести - по време на взаимодействието на подвижни микроби с флагеларни H-серуми. Той идва по-бързо от дребнозърнестия, получената утайка е много рохкава и лесно се разбива.

Интензивността на реакцията се изразява, както следва:

Всички клетки се утаяват, течността в епруветката е напълно прозрачна. Резултатът от реакцията е рязко положителен;

Утайката е по-малко, няма пълно просветляване на течността. Резултатът от реакцията е положителен;

Утайката е още по-малко, течността е по-мътна. Резултатът от реакцията е съмнителен;

на дъното на тръбата има незначителна утайка, течността е мътна. Съмнителен резултат от реакцията;

Няма утайка, течността е равномерно мътна, както при антигенния контрол. Отрицателен резултатреакции