Kas yra agliutinacijos reakcijos veikimo pagrindas. Agliutinacijos reakcija (RA), nustatymo mechanizmas ir metodai. Ingredientai ir kaip juos gauti. RA naudojimas diagnozuojant infekcines ligas. Imuninė elektroninė mikroskopija

Agliutinacijos reakcija

Agliutinacija (lot. agliutinacija- klijavimas) - antigeną turinčių korpuskulinių dalelių (visų ląstelių, latekso dalelių ir kt.) suklijavimas (sujungimas) su specifinių antikūnų molekulėmis, esant elektrolitams, kuris baigiasi dribsnių arba nuosėdų (agliutinato) susidarymu, matomu plika akimi. Nuosėdų pobūdis priklauso nuo antigeno pobūdžio: žvynelinės bakterijos suteikia stambias dribsnių nuosėdas, žiogelinės ir bekapsulės – smulkiagrūdės, kapsulinės – stygas. Išskirkite tiesioginę agliutinaciją, kai sąveika su specifiniais antikūnais tiesiogiai veikia savo bakterijos ar bet kurios kitos ląstelės, pavyzdžiui, eritrocitų, antigenus; ir netiesioginis, arba pasyvus, kai bakterijų ląstelės ar eritrocitai, arba latekso dalelės yra ne savo, o ant jų adsorbuotų svetimų antigenų (ar antikūnų) nešiotojai, kad aptiktų jiems būdingus antikūnus (ar antigenus). Agliutinacijos reakcija daugiausia apima antikūnus, priklausančius IgG ir IgM klasėms. Jis vyksta dviem etapais: pirma, yra specifinė aktyvaus antikūnų centro sąveika su antigeną lemiančiu veiksniu, ši stadija gali įvykti, kai nėra elektrolitų, be matomų pokyčių reaguojančioje sistemoje. Antrasis etapas, agliutinato susidarymas, reikalauja elektrolitų, kurie sumažina antigeno + antikūnų kompleksų elektrinį krūvį ir pagreitina jų klijavimo procesą. Ši fazė baigiasi agliutinato susidarymu.

Agliutinacijos reakcijos dedamos ant stiklinių arba ant lygių kartoninių plokštelių arba steriliuose agliutinacijos mėgintuvėliuose. Agliutinacijos reakcijos (tiesioginės ir pasyviosios) ant stiklo dažniausiai naudojamos kaip pagreitintas metodas specifiniams antikūnams paciento serume nustatyti (pavyzdžiui, sergant brucelioze) arba serologiniam patogeno identifikavimui. Pastaruoju atveju dažniausiai naudojami gerai išgryninti (adsorbuoti) diagnostiniai serumai, kuriuose yra tik monoreceptorių antikūnų arba jų rinkinys prieš įvairius antigenus. Neabejotinas agliutinacijos reakcijos ant stiklo pranašumas yra jo formulavimo paprastumas ir tai, kad tai trunka kelias minutes ar net sekundes, nes abu komponentai naudojami koncentruota forma. Tačiau jis turi tik kokybinę vertę ir yra mažiau jautrus nei mėgintuvėlis. Išplėstinis agliutinacijos testas mėgintuvėliuose duoda tikslesnius rezultatus, nes leidžia nustatyti kiekybinį antikūnų kiekį serume (nustatyti jo titrą) ir prireikus užregistruoti antikūnų titro padidėjimo faktą, kuris diagnostinė vertė. Reakcijai nustatyti į agliutinaciją įpilamas serumas, tam tikru būdu atskiestas 0,85 % NaCl tirpalu ir lygus tūris (paprastai 0,5 ml) standartinės diagnostinės medžiagos (arba tiriamosios kultūros), kurios 1 ml yra 1 milijardas bakterijų, suspensijos. vamzdeliai. Agliutinacijos reakcijos rezultatai apskaitomi iš anksto po 2 valandų inkubacijos mėgintuvėliuose 37 ° C temperatūroje ir galiausiai po 20–24 valandų pagal du kriterijus: nuosėdų buvimą ir dydį bei nuosėdų laipsnį. supernatanto skaidrumas. Vertinimas atliekamas pagal keturių kryžių sistemą. Reakciją būtinai lydi serumo ir antigeno kontrolė. Tais atvejais, kai serologiniam sukėlėjo identifikavimui naudojamas išsamus agliutinacijos mėgintuvėlyje tyrimas, jis turi diagnostinę reikšmę, jei reakcija vertinama teigiama, kai diagnostinis serumas skiedžiamas ne mažiau kaip puse jo titro.

Reikėtų atsižvelgti į tai, kad maišant homologinių antigenų ir antikūnų tirpalus ne visada pastebimi matomi agliutinacijos reakcijos pasireiškimai. Nuosėdos susidaro tik esant tam tikriems optimaliems abiejų reakcijos komponentų santykiams. Už šių ribų, esant dideliam antigeno ar antikūnų pertekliui, reakcijos nepastebima. Šis reiškinys vadinamas „prozono reiškiniu“. Jis stebimas tiek agliutinacijos, tiek kritulių reakcijos metu. Prozono atsiradimas imuninėse reakcijose paaiškinamas tuo, kad jose dalyvaujantys antigenai, kaip taisyklė, yra polideterminantiniai, o molekulės IgG antikūnai turi du aktyvius centrus. Esant antikūnų pertekliui, kiekvienos antigeno dalelės paviršius pasidengia antikūnų molekulėmis, kad neliktų laisvų determinantų grupių, todėl antrasis, neprisijungęs aktyvus antikūnų centras negali sąveikauti su kita antigenine dalele ir surišti jų vienas su kitu. Taip pat nuslopinamas matomo agliutinato ar nuosėdų susidarymas, kai yra antigeno perteklius, kai nelieka nei vienos laisvos aktyvios antikūnų vietos, todėl antigenas + antikūnas + antigenas kompleksų nebegalima padidinti.

mikrobiologijoje

„Agliutinacijos reakcija ir jos tipai (RA)“

Planas:

1. Įvadas……………………………………………………………………………………..3

2. RA ant stiklo……………………………………………………………………………………….4

3. Mėgintuvėlis PA………………………………………………………………………………….5

4. Naudota literatūra……………………………………………………………………..7

1. Įvadas.

Mikrobų antigeno ir antikūnų sąveika yra griežtai specifinė ir nukreipta į gyvūno organizmą neutralizuoti patogeną ir jo toksinus. Antigeno ir antikūnų sąveiką in vitro tam tikromis sąlygomis lydi matomi reiškiniai (agliutinacija, nusodinimas, imuninė lizė), o tai leidžia praktiniais tikslais panaudoti AG-AT reakcijas, vadinamas serologine (iš lot. serumas-serum). Biofabrikai gamina žinomos specifinės krypties (diagnostikos) antigenus ir imuninius serumus (antikūnus). Tokių serumų pagalba serologinėse reakcijose galima identifikuoti nežinomą mikroorganizmą arba, naudojant žinomą antigeną, aptikti organizme antikūnus, susintetintus reaguojant į patogeno patekimą, ir taip nustatyti diagnozę (serologinę diagnozę) . Be to, serologinėmis reakcijomis galima įvertinti imuninio atsako intensyvumą po vakcinacijos ar infekcinės ligos.

Agliutinacijos reakcijos, tokios kaip netiesioginė agliutinacija ir Kumbsas, yra pagrįstos korpuskulinių antigenų sąveika in vitro su antikūnais ir susidarančių kompleksų gebėjimu nusodinti. Kaip korpuskuliniai antigenai naudojamos bakterijų ląstelės arba tirpūs antigenai, ekstrahuojami iš mikroorganizmų ir adsorbuojami ant nešiklio korpusų: eritrocitų, latekso dalelių ir kt.

Korpuskulinių antigenų antigeniniai determinantai specifiškai sąveikauja su homologiniais antikūnais (specifinė, nematoma reakcijos fazė), o tada iš antigeno-antikūnų kompleksų susidaro dideli, plika akimi matomi konglomeratai, kurie nusėda – agliutina (nespecifinė, matoma reakcijos fazė) . Mikrobų (Brucella) formose susidaro granuliuoti agliutantai, žvyneliuose (Escherichia, Salmonella) - stambia medvilnė, kurie apversto skėčio pavidalu nusėda ant mėgintuvėlio dugno ir lengvai sulaužomi pakratant. . Antigenai ir antikūnai sąveikauja tik esant elektrolitui (0,8 % natrio chlorido tirpale). Reakcijos eigai įtakos turi druskos koncentracija elektrolite, mikrobų ląstelių skaičius suspensijoje, koncentracija serume, pH, temperatūra ir kiti veiksniai.

Agliutinacijos reakcija (ra).

Išskirkite specifinę agliutinaciją, spiečius remiasi antigeno sąveika Su homologinis antikūnas , esantis gyvūno kūne, Krom buvo įvestas šis antigenas (imunoagliutinacija); nespecifinis (cheminis), atsirandantis dėl aplinkos pH, elektrolitų koncentracijos pokyčių; spontaniškas, to-ruyu stebimas, kai bakterijos (kurios yra R formos) suspenduojamos fiziologiniame tirpale ir kaitinamas, o tai yra susiję su bakterinės ląstelės koloidinės būsenos pasikeitimu. Antigenas , dalyvaujantis RA, vadinamas agliutinogenu, antikūnas vadinamas agliutininu, susidariusios nuosėdos vadinamos agliutinatu. Susidarant agliutinatui, svarbus kiekybinis antigeno ir antikūnų santykis (optimalus reiškinys). Esant antikūnų pertekliui arba trūkumui, A.

Agliutinacijos reakcija (RA) yra viena iš pirmųjų imunologinių reakcijų, naudojamų mikrobiologinėje praktikoje. Pirmą kartą (1895 m.) F. Vidalis panaudojo RA vidurių šiltinės diagnozei. Vėliau (1897 m.) A. Wright panaudojo tą pačią reakciją diagnozuodamas bruceliozę žmonėms. RA taip pat buvo pritaikyta viščiukų pulorozei, leptospirozei, infekciniam kumelių abortui diagnozuoti, taip pat nežinomų mikrobų kultūrų tipavimui pagal žinomą agliutinuojantį serumą. RA yra labai jautrus; jis gali aptikti 0,01 µg antikūnų baltymo azoto 1 ml.

Sukurti keli agliutinacijos reakcijos variantai, kurie skiriasi metodiniu įgyvendinimu ir tyrimo tikslu.

2. Ra ant stiklo.

Šiame RA variante galima tirti ir serumą, ir antigeną, tačiau šis variantas dažniausiai naudojamas mikroorganizmų identifikavimui.

1. Norint nustatyti mikroorganizmą (m/o), ant nuriebalinto stiklelio atskirai užlašinamas lašas žinomo agliutinuojančio serumo, pvz., nuo salmoneliozės, ir lašas druskos tirpalo (kontrolė). Tada, naudojant bakteriologinę kilpą, tiriamos kultūros bakterijų masė paimama iš kolonijos Petri lėkštelėje arba nuo pasvirusios MPA paviršiaus mėgintuvėlyje ir atskirai suspenduojama imuniniame serume ir fiziologiniame fiziologiniame tirpale, kol gaunama vienalytė suspensija. . Į rezultatą atsižvelgiama po 2 ... 4 minučių.

Rezultatų apskaita: kontrolinės imties pokyčių neturėtų būti. Esant specifiniam bakterijų kultūros atitikimui imuniniam serumui, atsiranda agliutinato dribsniai (teigiamas rezultatas), nesant agliutinacijos reiškinio, daroma išvada, kad tirta bakterijų kultūra neatitinka imuninio serumo.

2. Antikūnų aptikimas tirtame kraujo serume bus svarstomas naudojant rožių-bengalijos testo pavyzdį, naudojamą bruceliozės serodiagnostikai. Ant stiklelio užtepama 0,3 ml tiriamo gyvūno kraujo serumo ir 0,03 ml brucelos antigeno (brucelos ląstelės, nudažytos rožine Bengal spalva). Komponentai kruopščiai sumaišomi purtant stiklinę ir į rezultatą atsižvelgiama po 4 minučių.

Apskaitos rezultatai: esant teigiamai reakcijai, atsiranda rausvų agliutinato dribsnių. Šio tipo serologinė reakcija priskiriama kokybinei, nes pagal ją galima aptikti patogeno antikūnus gyvūno kraujo serume, tačiau neįmanoma įvertinti kiekybinio jų kiekio.

Agliutinacijos reakcija (RA) – tai mikrobų ar kitų ląstelių sukibimas ir nusodinimas, veikiant antikūnams, esant elektrolitui. Susidariusios nuosėdos vadinamos agliutinatu.

RA naudojamas:

1. Antikūnams nustatyti paciento kraujo serume (serodiagnostika).

2. Nustatyti iš paciento išskirtos patogeninių mikroorganizmų grynosios kultūros tipą ir serovarą (serotipų nustatymas).

Agliutinacijos reakcija naudojama antikūnams nustatyti pacientų, pavyzdžiui, vidurių šiltine ir paratifu (Vidal reakcija), brucelioze (Wright, Huddleson reakcijos), tuliaremija, leptospiroze ir kitomis infekcinėmis ligomis, kraujo serume, taip pat nustatyti. ligos sukėlėjas, išskirtas iš paciento (žarnyno infekcijos, kokliušas ir kt.). RA naudojamas kraujo grupėms, Rh faktoriui nustatyti ir kt.

Reakcijai reikalingi šie komponentai:

1. Antigenas (agliutinogenas) turi būti korpuskulinis, tai yra gyvų ar žuvusių mikroorganizmų (diagnozė m), eritrocitų ar kitų ląstelių suspensija. Paprastai naudojama kasdienė mikroorganizmų kultūra, auginama ant agaro nuolydžio. Kultūra nuplaunama 3-4 ml izotoninio tirpalo, perkeliama į sterilų mėgintuvėlį ir nustatomas tankis. Suspensija turi būti vienalytė ir 1 ml turi būti iki 3 milijardų mikrobų ląstelių. Darbą palengvina nužudytų mikrobų suspensijos – diagnostikos – naudojimas (pagaminta gamykloje).

2. Antikūnai (agliutininai) randami paciento serume (su serodiagnostika) arba agliutinuojančiame serume (su serotipais). Agliutinuojantys serumai gaunami imunizuojant triušius nužudytomis bakterijomis.

Titras agliutinuojantis serumas vadinamas didžiausiu jo praskiedimu, kuriame jis nereaguoja su atitinkamu antigenu tam tikromis eksperimentinėmis sąlygomis.

Agliutinuojantys serumai gali būti natūralūs (neadsorbuoti) ir adsorbuoti. Natūralūs serumai nedideliais praskiedimais sąveikauja ne tik su mikroorganizmais, su kuriais gyvūnas buvo imunizuotas, kad gautų serumą, bet ir su giminingų tipų mikroorganizmais, nes juose yra grupinių antikūnų (antikūnų prieš mikroorganizmus, turinčius bendrų antigenų). Natūralūs serumai naudojami išplėstinei agliutinacijos reakcijai (su serodiagnoze), kuri atsižvelgia ne tik į reakcijos buvimą, bet ir į antikūnų titro padidėjimo dinamiką.

Jei grupės antikūnai ekstrahuojami (adsorbuojami) iš natūralaus serumo sąveikaujant su giminingomis bakterijomis, turinčiomis grupės antigenus, gaunami adsorbuoti serumai. Adsorbuoti serumai gali būti monoreceptoriniai (arba tipo specifiniai), turintys antikūnų tik prieš vieną antigeno receptorių. Daugiavalenčiai serumai susideda iš kelių adsorbuotų arba neadsorbuotų serumų mišinio. Adsorbuoti serumai naudojami agliutinacijos reakcijai ant stiklo.

Kai gyvūnai imunizuojami judriomis bakterijomis su H antigenu, gaunami H agliutinuojantys serumai, kuriuose yra H antikūnų (pavyzdžiui, Salmonella monoreceptorių H agliutinuojantis serumas). Imunizuojant O-antigenu susidaro O-agliutinuojantys serumai, kuriuose yra O-antikūnų (pavyzdžiui, salmonelių grupės adsorbuotas O-agliutinuojantis serumas, anticholerinis O-agliutinuojantis serumas). Imunizuojant H ir O antigenais susidaro serumai su H ir O antikūnais.

Be to, O-agliutininai sudaro smulkiagrūdį agliutinatą, o H-agliutininai – stambiagrūdžias nuosėdas.

3. Elektrolitas – izotoninis NaCl tirpalas (0,9 % natrio chlorido tirpalas paruoštas distiliuotu vandeniu).

Yra du pagrindiniai agliutinacijos reakcijos nustatymo būdai: reakcija ant stiklo (kartais vadinama orientacine arba sluoksnine) ir išplėstinė reakcija (mėgintuvėliuose).

Stiklo agliutinacijos reakcijos teiginys. Du lašai serumo ir lašas izotoninio natrio chlorido tirpalo užlašinami ant neriebaus stiklelio. Diagnostinis agliutinuojantis serumas imamas vienu skiedimu, kuris, priklausomai nuo jo titro, yra 1:10, 1:25, 1:50 arba 1:100. Į vieną iš serumo lašų ir lašą izotoninio tirpalo kilpa įvedama tiriamo mikroorganizmo kultūra ir gerai išmaišoma. Lašas natrio chlorido su mikroorganizmais yra antigeno kontrolė, serumo lašas be mikroorganizmų yra serumo kontrolė. Neperkelkite kultūros iš serumo lašo į NaCl lašą. Reakcija vyksta kambario temperatūroje 1-3 min. Jei serumo kontrolė išlieka skaidri, antigeno kontrolėje stebimas vienodas drumstumas, o laše, kuriame kultūra sumaišoma su serumu, atsiranda agliutinato dribsnių, tada rezultatas laikomas teigiamu. Jei laše su serumu ir antigenu yra vienodas drumstumas, tai yra neigiamas rezultatas. Reakcija aiškiau matoma tamsiame fone.

Serumas

1. antigeno kontrolė

2. serumo kontrolė

imunodiagnostinės reakcijos. Antigeno-antikūnų reakcijos ir reakcijos su pažymėtais komponentais. Naudojimas mikroorganizmų identifikavimui ir diagnostikos tikslais užkrečiamos ligos.

Imuninės reakcijos naudojamos diagnostiniuose ir imunologiniuose tyrimuose pacientams ir sveikų žmonių. Šiuo tikslu kreipkitės serologiniai metodai(iš lat. serumas - serumas ir logotipai - doktrina), ty antikūnų ir antigenų tyrimo metodai, naudojant antigeno-antikūno reakcijas, nustatytas kraujo serume ir kituose skysčiuose, taip pat kūno audiniuose.

Paciento kraujo serume nustačius antikūnus prieš patogeno antigenus, galima diagnozuoti ligą. Serologiniais tyrimais taip pat nustatomi mikrobų antigenai, įvairios biologiškai aktyvios medžiagos, kraujo grupės, audinių ir navikų antigenai, imuniniai kompleksai, ląstelių receptoriai ir kt.

Kai iš paciento išskiriamas mikrobas, patogenas nustatomas tiriant jo antigenines savybes naudojant imuninės diagnostikos serumus, t. y. hiperimunizuotų gyvūnų kraujo serumus, kuriuose yra specifinių antikūnų. Šis vadinamasis serologinis identifikavimas mikroorganizmai.

Mikrobiologijoje ir imunologijoje plačiai naudojamos agliutinacijos, nusodinimo, neutralizavimo reakcijos, reakcijos, kuriose dalyvauja komplementas, naudojant žymėtus antikūnus ir antigenus (radioimunologiniai, fermentų imunologiniai, imunofluorescenciniai metodai). Išvardytos reakcijos skiriasi registruotu poveikiu ir nustatymo technika, tačiau visos jos yra pagrindinės. mikroautobusai apie antigeno sąveikos su antikūnu reakciją ir yra naudojami tiek antikūnams, tiek antigenams aptikti. Imuniteto reakcijos pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu.

Toliau pateikiami pagrindinių imunodiagnostinių reakcijų principai ir schemos. Pateikta išsami reakcijų nustatymo technika. praktinės imunodiagnostikos gairės.

Agliutinacijos reakcija – RA(iš lat. agluti- natio- surišimas) - paprasta reakcija, kurios metu antikūnai suriša korpuskulinius antigenus (bakterijas, eritrocitus ar kitas ląsteles, netirpias daleles su ant jų adsorbuotais antigenais, taip pat stambiamolekulinius agregatus). Jis atsiranda esant elektrolitams, pavyzdžiui, kai pridedamas izotoninis natrio chlorido tirpalas.

Naudojami įvairūs agliutinacijos reakcijos variantai: išplėstinė, apytikslė, netiesioginė ir kt. Agliutinacijos reakcija pasireiškia dribsnių ar nuosėdų susidarymu

RA naudojamas:

antikūnų nustatymas pacientų kraujo serume, pavyzdžiui, sergančių brucelioze (Wright, Heddelson reakcijos), vidurių šiltine ir paratifu (Vidal reakcija) ir kitomis infekcinėmis ligomis;

iš paciento išskirto patogeno nustatymas;

kraujo grupių nustatymas naudojant monokloninius antikūnus prieš eritrocitų alogenus.

Paciento antikūnams nustatyti įdėtiišplėstinė agliutinacijos reakcija: pridėti prie paciento kraujo serumo skiedimų diagnostika(žuvusių mikrobų suspensija) ir po kelių valandų inkubavimo 37 ° C temperatūroje pažymimas didžiausias serumo praskiedimas (serumo titras), kuriam esant įvyko agliutinacija, t.y. susidarė nuosėdos.

Agliutinacijos pobūdis ir greitis priklauso nuo antigeno ir antikūnų tipo. Pavyzdys yra diagnostinių medžiagų (O- ir R-antigenų) sąveikos su specifiniais antikūnais ypatybės. Agliutinacijos reakcija su O-diagnostika(bakterijos žūsta karščio metu, išlaiko termostabilumą O antigenas) atsiranda smulkiagrūdės agliutinacijos pavidalu. Agliutinacijos reakcija su H-diagnosticum (bakterijos, naikinamos formalinu, išlaikančios karščiui labilų žiuželinį H-antigeną) yra stambiagrūdė ir vyksta greičiau.

Jei reikia nustatyti iš paciento išskirtą sukėlėją, įdėti orientacinė agliutinacijos reakcija, naudojant diagnostinius antikūnus (agliutinuojantį serumą), t.y. atliekamas patogeno serotipų nustatymas. Apytikslė reakcija atliekama ant stiklelio. Į lašą diagnostinio agliutinuojančio serumo, praskiedus 1:10 arba 1:20, įlašinkite gryną patogeno kultūrą, išskirtą iš paciento. Šalia dedama kontrolė: vietoj serumo užlašinamas lašas natrio chlorido tirpalo. Kai laše su serumu ir mikrobais atsiranda flokuliuojančios nuosėdos, jie įdeda plati agliutinacijos reakcija mėgintuvėliuose su didėjančiais agliutinuojančio serumo praskiedimais, į kuriuos įlašinami 2-3 lašai patogeno suspensijos. Į agliutinaciją atsižvelgiama pagal nuosėdų kiekį ir skysčio skaidrumo laipsnį. Reakcija laikoma teigiama, jei agliutinacija pastebima praskiedimu, artimu diagnostinio serumo titrui. Tuo pačiu metu atsižvelgiama į kontrolę: izotoniniu natrio chlorido tirpalu praskiestas serumas turi būti skaidrus, mikrobų suspensija tame pačiame tirpale turi būti tolygiai drumsta, be nuosėdų.

Skirtingos susijusios bakterijos gali būti agliutinuojamos naudojant tą patį diagnostinį agliutinuojantį serumą, todėl jas sunku nustatyti. Todėl mėgaukitės adsorbuoti agliutinuojantys serumai, iš kurių kryžmiškai reaguojantys antikūnai buvo pašalinti adsorbuojant su jais susijusioms bakterijoms. Tokiuose serumuose lieka tik šiai bakterijai būdingų antikūnų. Tokiu būdu paruošti monoreceptorių diagnostikos agliutinuojančius serumus pasiūlė A. Castellani (1902).

Netiesioginės (pasyviosios) hemagliutinacijos reakcija (RNGA, RPHA) pagrįstas eritrocitų panaudojimu su antigenais arba ant paviršiaus adsorbuotais antikūnais, kurių sąveika su atitinkamais kamuoliuko kraujo serumo antikūnais arba antigenais priverčia eritrocitus sulipti ir nukristi į dugną. mėgintuvėlį arba ląstelę Všukuotų nuosėdų forma (13.2 pav.). At atsakas eritrocitai nusėda „mygtuko“ pavidalu. Paprastai antikūnai RNHA aptinkami naudojant antigeninę eritrocitų diagnostiką, tai yra eritrocitai su adsorbuota. įjungta jų antigenai. Kartais naudojame antikūnų eritrocitų diagnostiką, ant kurios adsorbuojami antikūnai. Pavyzdžiui, botulino toksiną galima aptikti pridedant prie jo eritrocitų antikūnų botulinum diagnosticum (ši reakcija vadinama atvirkštinė netiesioginė hemagliutinacijos reakcija- RONGA). RNHA naudojama infekcinėms ligoms diagnozuoti, gonadotropiniam hormonui nustatyti Všlapimas nėštumo metu, siekiant nustatyti padidėjusį jautrumą vaistai, hormonai ir kai kuriais kitais atvejais.

Koagliutinacijos reakcija . Patogeninės ląstelės nustatomos naudojant stafilokokus, iš anksto apdorotus imuninės diagnostikos serumu. Baltymų turintys stafilokokai A, turintis afinitetą Fc -imunoglobulinų fragmentas, nespecifiškai adsorbuoja antimikrobinius antikūnus, kurie vėliau sąveikauja su aktyviais centrais su atitinkamais iš pacientų išskirtais mikrobais. Dėl koaguliacijos susidaro dribsniai, susidedantys iš stafilokokų, diagnostinių serumo antikūnų ir nustatomo mikrobo.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija (RTGA) paremta blokada, virusų antigenų slopinimu imuninio serumo antikūnais, dėl ko virusai praranda gebėjimą agliutinuoti raudonuosius kraujo kūnelius (13.3 pav.). RTHA naudojama diagnozuoti daugybę virusinių ligų, kurių sukėlėjai (gripas, tymai, raudonukė, erkinis encefalitas ir kt.) gali agliutinuoti įvairių gyvūnų eritrocitus.

Agliutinacijos reakcija kraujo grupėms nustatyti naudojamas ABO sistemai nustatyti (žr. 10.1.4.1 skyrių), naudojant eritrocitų agliutinaciją imuninio serumo antikūnais prieš A (II), B (III) kraujo grupių antigenus. Kontrolė yra: serumas be antikūnų, t. y. serumas AB (GU) kraujo grupės; antigenai, esantys A (II), B (III) grupių eritrocituose. Neigiamoje kontrolėje nėra antigenų, t. y. naudojami 0 (I) grupės eritrocitai.

IN agliutinacijos reakcijos Rh faktoriui nustatyti(žr. 10.1.4.1 skyrių) naudokite anti-Rh serumus (bent dvi skirtingas serijas). Esant Rh antigenui ant tiriamų eritrocitų membranos, įvyksta šių ląstelių agliutinacija. Standartiniai visų kraujo grupių Rh teigiami ir Rh neigiami eritrocitai yra kontroliniai.

Agliutinacijos reakcija, skirta antireuso antikūnams nustatyti ( netiesioginė reakcija Combs)vartojamas pacientams, sergantiems intravaskuline hemolize. Kai kuriems iš šių pacientų randami anti-reuso antikūnai, kurie yra nepilni, monovalentiniai. Jie konkrečiai sąveikauja su Rh teigiamais eritrocitais, bet nesukelia jų agliutinacijos. Tokių nepilnų antikūnų buvimas nustatomas netiesioginėje Kumbso reakcijoje. Tam į anti-Rh antikūnų + Rh teigiamų eritrocitų sistemą pridedamas antiglobulino serumas (antikūnai prieš žmogaus imunoglobulinus), kuris sukelia eritrocitų agliutinaciją (13.4 pav.). Taikant Kumbso reakciją, diagnozuojamos patologinės būklės, susijusios su imuninės kilmės eritrocitų intravaskuline lize, pavyzdžiui, naujagimio hemolizinė liga: Rh teigiamo vaisiaus eritrocitai susijungia su kraujyje cirkuliuojančiais nepilnais antikūnais prieš Rh faktorių, kuris kertasi. placenta iš Rh neigiamos motinos.

Kritulių reakcijos

kritulių reakcija - RP (nuolat. praeci-pito- nuosėdos) yra tirpaus molekulinio antigeno komplekso su antikūnais susidarymas ir nusodinimas drumstumo pavidalu, vadinamas nuosėdos. Jis susidaro sumaišius antigenus ir antikūnus lygiaverčiais kiekiais; vieno iš jų perteklius sumažina imuninio komplekso susidarymo lygį.

Nusodinimo reakcijos dedamos į mėgintuvėlius (žiedo nusodinimo reakcija), geliuose, maistinėse terpėse ir kt. Plačiai naudojamos nusodinimo reakcijos pusiau skystame agaro arba agarozės gelyje: dviguba imunodifuzija pagal Ouchterlony. radialinė imunodifuzija, imunoelektroforezė ir kt.

Žiedo kritulių reakcija . Reakcija vykdoma siauruose nusodinamuosiuose mėgintuvėliuose su imuniniu serumu, ant kurio yra sluoksniuotas tirpus antigenas. Esant optimaliam antigeno ir antikūnų santykiui, prie šių dviejų tirpalų ribos susidaro nepermatomas nuosėdų žiedas (13.5 pav.). Antigeno perteklius neturi įtakos žiedo nusodinimo reakcijos rezultatui dėl laipsniško reagentų difuzijos iki skysčio ribos. Jeigu žiedinio nusodinimo reakcijoje kaip antigenai naudojami virti ir filtruoti vandeniniai organų ar audinių ekstraktai, tai tokia reakcija vadinama termoprecipitacijos reakcija-iii (Ascoli reakcija, su juodlige /

Oukhteruni dviguba imunodifuzijos reakcija . Reakcijai nustatyti ištirpęs agaro gelis plonu sluoksniu užpilamas ant stiklinės plokštelės, o jam sukietėjus išpjaunamos 2-3 mm dydžio skylės. Antigenai ir imuniniai serumai yra dedami atskirai į šiuos šulinėlius, kurie difunduoja vienas į kitą. Susitikimo vietoje lygiavertėmis proporcijomis jie sudaro nuosėdas baltos juostos pavidalu. Daugiakomponentėse sistemose tarp šulinių su skirtingais antigenais ir serumo antikūnais atsiranda kelios nuosėdų linijos; identiškiems antigenams nuosėdų linijos susilieja; netapatiesiems jie susikerta (13.6 pav.).

Radialinė imunodifuzijos reakcija . Imuninis serumas su išlydytu agaro geliu tolygiai užpilamas ant stiklinės. Sustingus gelyje, padaromos duobutės, į kurias dedamas įvairiais atskiedais antigenas. Antigenas, difunduodamas į gelį, aplink šulinėlius su antikūnais sudaro žiedines nuosėdų zonas (13.7 pav.). Nusodinimo žiedo skersmuo yra proporcingas antigeno koncentracijai. Reakcija naudojama įvairių klasių imunoglobulinų, komplemento sistemos komponentų ir kt.

Imunoelektroforezė- elektroforezės ir imunoprecipitacijos metodo derinys: į gelio duobutes įvedamas antigenų mišinys ir elektroforezės būdu atskiriamas gelyje. Tada lygiagrečiai elektroforezės zonoms į griovelį įvedamas imuninis serumas, kurio antikūnai, difunduodami į gelį, susidaro susitikimo vietoje su kritulių linijos antigenu.

flokuliacijos reakcija(pagal Ramonas) (iš lat. flokas- vilnos dribsniai) - opalescencijos arba flokuliuojančios masės (imunoprecipitacijos) atsiradimas mėgintuvėlyje vykstant toksino-antitoksino arba anatoksino-antitoksino reakcijai. Jis naudojamas antitoksinio serumo ar toksoido aktyvumui nustatyti.

Imuninė elektroninė mikroskopija- mikrobų, dažniau virusų, apdorotų atitinkamais antikūnais, elektroninė mikroskopija. Virusai, apdoroti imuniniu serumu, sudaro imuninius agregatus (mikronuosėdas). Aplink virionus susidaro antikūnų „korola“, kontrastuojanti su fosfotungsto rūgštimi ar kitais elektronų optiškai tankiais preparatais.

Reakcijos, apimančios komplementą

Reakcijos, apimančios komplementąpagrįstas komplemento aktyvavimu antigeno-antikūno kompleksu (komplemento fiksavimo reakcija, radialinė hemolizė ir kt.).

Komplemento fiksavimo reakcija (RSK) slypi tame, kad vienas kitą atitinkantys antigenai ir antikūnai sudaro imuninį kompleksą, kuriam per Fc -antikūnų fragmentas prisijungia prie komplemento (C), t.y. komplemento surišimas vyksta su antigeno-antikūno kompleksu. Jei antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro, tai komplementas lieka laisvas (13.8 pav.). RSK vykdoma dviem etapais: 1-oji fazė – mišinio, kuriame yra trys antigeno + antikūno + komplemento komponentai, inkubavimas; 2 fazė (indikatorius) - laisvo komplemento aptikimas mišinyje, pridedant prie jo hemolizinę sistemą, susidedančią iš avių eritrocitų ir hemolizinio serumo, kuriame yra antikūnų prieš juos. 1-oje reakcijos fazėje, formuojantis antigeno-antikūno kompleksui, įvyksta komplemento surišimas, o po to 2-oje fazėje antikūnais įjautrintų eritrocitų hemolizė nevyks; reakcija teigiama. Jei antigenas ir antikūnas neatitinka vienas kito (tiriamame mėginyje nėra antigeno ar antikūno), komplementas lieka laisvas ir 2-oje fazėje susijungs su eritrocitų-antieritrocitų antikūnų kompleksu, sukeldamas hemolizę; reakcija neigiama.

RSK naudojamas diagnozuoti daugelį infekcinių ligų, ypač sifilį (Wassermano reakcija).

Radialinės hemolizės reakcija (RRH ) dedama į agaro gelio šulinėlius, kuriuose yra avino eritrocitų ir komplemento. Į gelio šulinėlius įpylus hemolizinio serumo (antikūnų prieš avino eritrocitus), aplink juos susidaro hemolizės zona (dėl radialinės antikūnų difuzijos). Taigi galima nustatyti komplemento ir hemolizinio serumo aktyvumą, taip pat antikūnus sergančiųjų gripu, raudonuke, erkiniu encefalitu kraujo serume. Tam ant eritrocitų adsorbuojami atitinkami viruso antigenai, o į gelio, kuriame yra šie eritrocitai, duobutes pilamas paciento kraujo serumas. Antivirusiniai antikūnai sąveikauja su viruso antigenais, adsorbuotais ant eritrocitų po

Prie šio komplekso prisijungia komplemento komponentai, sukeldami hemolizę.

Imuninės adhezijos reakcija (RIP ) yra pagrįstas komplemento sistemos aktyvavimu korpuskuliniais antigenais (bakterijomis, virusais), apdorotais imuniniu serumu. Dėl to susidaro aktyvuotas trečiasis komplemento komponentas (C3b), kuris prisijungia prie korpuskulinio antigeno kaip imuninio komplekso dalis. Ant eritrocitų, trombocitų, makrofagų yra C3b receptoriai, dėl kurių šios ląstelės susimaišo su imuniniais kompleksais, turinčiais C3b, susijungia ir agliutinuojasi.

Neutralizacijos reakcija

Imuniniai serumo antikūnai gali neutralizuoti žalingą mikrobų ar jų toksinų poveikį jautrioms ląstelėms ir audiniams, kuris yra susijęs su mikrobų antigenų blokavimu antikūnais, t.y. neutralizavimas. Neutralizacijos reakcija(RN) atliekama įvedant antigeno ir antikūnų mišinį gyvūnams arba jautriems tiriamiesiems objektams (ląstelių kultūrai, embrionams). Nesant žalingo mikroorganizmų ar jų antigenų, toksinų poveikio gyvūnams ir tiriamiesiems objektams, jie kalba apie neutralizuojantį imuninio serumo poveikį, taigi ir apie antigeno-antikūno komplekso sąveikos specifiškumą (13.9 pav.).

Imunofluorescencinė reakcija – RIF (Koonso metodas)

Yra trys pagrindinės metodo atmainos: tiesioginis, netiesioginis (13.10 pav.), su papildiniu. Koonso reakcija yra greitas diagnostikos metodas mikrobų antigenams arba antikūnams aptikti.

Tiesioginis RIF metodas remiasi tuo, kad audinių antigenai arba mikrobai, apdoroti imuniniais serumais su fluorochromais paženklintais antikūnais, gali švytėti fluorescencinio mikroskopo UV spinduliuose.

Bakterijos tepinėlyje, apdorotos tokiu liuminescenciniu serumu, švyti išilgai ląstelės periferijos žalio krašto pavidalu.

Netiesioginis RIF metodas yra nustatyti antigeno-antikūno kompleksą naudojant antiglobulino (anti-antikūno) serumą, pažymėtą fluorochromu. Norėdami tai padaryti, tepinėliai iš mikrobų suspensijos apdorojami antimikrobinio triušio diagnostinio serumo antikūnais. Tada mikrobų antigenais nesurišti antikūnai nuplaunami, o ant mikrobų likę antikūnai aptinkami apdorojant tepinėlį antiglobulino (antitriušio) serumu, paženklintu fluorochromais. Dėl to susidaro kompleksinis mikrobas + antimikrobiniai triušių antikūnai + anti-triušių antikūnai, pažymėti fluorochromu. Šis kompleksas stebimas fluorescenciniu mikroskopu, kaip ir tiesioginiu metodu.

ELISA metodas arba analizė (ELISA)

ELISA -antigenų aptikimas naudojant atitinkamus antikūnus, konjuguotus su žymėjimo fermentu (krienų peroksidaze, beta-galaktozidaze arba šarmine fosfataze). Sujungus antigeną su fermentu pažymėtu imuniniu serumu, į mišinį pridedamas substratas/chromogenas. Substratas skaidomas fermento, o reakcijos produkto spalva pasikeičia – spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.

Kietosios fazės ELISA - labiausiai paplitęs imunologinio tyrimo variantas, kai vienas iš imuninio atsako komponentų (antigenas arba antikūnai) adsorbuojamas ant kieto nešiklio, pavyzdžiui, polistireno plokštelių šuliniuose.

Nustatant antikūnus, paciento kraujo serumas, fermentu paženklintas antiglobulino serumas ir fermento substratas (chromogenas) paeiliui įpilami į plokštelių šulinėlius su adsorbuotu antigenu.

Kiekvieną kartą po kito komponento pridėjimo neprisirišę reagentai pašalinami iš šulinių kruopščiai nuplaunant. At teigiamas rezultatas pasikeičia chromogeno tirpalo spalva. Kietosios fazės nešiklis gali būti jautrinamas ne tik antigenu, bet ir antikūnais. Tada norimas antigenas įvedamas į duobutes su adsorbuotais antikūnais, įpilamas imuninis serumas prieš antigeną, pažymėtą fermentu, ir tada pridedamas fermento substratas.

Konkurencinga ELISA . tikslinis antigenas ir fermentu pažymėtas antigenas konkuruoja tarpusavyje dėl riboto imuninio serumo antikūnų kiekio surišimo. Kitas tyrimas yra antikūnai, kurių ieškote

ir pažymėti antikūnai konkuruoja tarpusavyje dėl antigenų.

Radioimunologinis metodas arba analizė (RIA)

Labai jautrus metodas, pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija, naudojant antigenus arba antikūnus, paženklintus radionuklidu (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr ir kt.). Po jų sąveikos susidaręs radioaktyvus imuninis kompleksas yra atskiriamas ir jo radioaktyvumas nustatomas atitinkamame skaitiklyje (beta arba gama spinduliuotė):

spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.

At kietosios fazės RIA versija vienas iš reakcijos komponentų (antigenas arba antikūnai) adsorbuojamas ant kieto nešiklio, pavyzdžiui, polistireno mikrogardelių šuliniuose. Kita metodo versija yra konkurencingą RIA. tikslinis antigenas ir radionuklidais pažymėtas antigenas konkuruoja tarpusavyje dėl riboto imuninio serumo antikūnų kiekio surišimo. Ši parinktis naudojama antigeno kiekiui tiriamojoje medžiagoje nustatyti.

RIA naudojama mikrobų antigenams aptikti, hormonams, fermentams, vaistinių medžiagų ir imunoglobulinai, taip pat kitos medžiagos, esančios bandomojoje medžiagoje nedidelėmis koncentracijomis - 10 ~ 0 -I0 ~ 12 g / l. Metodas kelia tam tikrą pavojų aplinkai.

Imunoblotingas

Imunoblotingas (IB)- labai jautrus metodas, pagrįstas elektroforezės ir ELISA arba RIA deriniu.

Antigenas išskiriamas naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę, tada perkeliamas (blotingas - iš anglų k. dėmė, dėmė) nuo gelio ant aktyvuoto popieriaus arba nitroceliuliozės membranos ir sukurta ELISA metodu. Firmos gamina tokias juosteles su „dėmėmis“

antigenai. Ant šių juostelių tepamas paciento serumas. Tada, po inkubacijos, pacientas nuplaunamas nuo neprisijungusių paciento antikūnų ir užtepamas fermentu paženklintas serumas prieš žmogaus imunoglobulinus. Ant juostelės susidaręs kompleksinis antigenas + paciento antikūnas + antikūnas prieš žmogaus Ig aptinkamas pridedant substrato / chromogeno, kuris keičia spalvą veikiant fermentui (13.12 pav.).

IB naudojamas kaip ŽIV infekcijos diagnostikos metodas ir kt.

Agliutinacija – tai mikrobų ar kitų ląstelių agliutinacija ir nusodinimas, veikiant antikūnams, esant elektrolitui (izotoniniam natrio chlorido tirpalui). Lipnių bakterijų (ląstelių) grupės vadinamos agliutinatais. Agliutinacijos reakcijai reikalingi šie komponentai:

1. Antikūnai (agliutininai), kurie yra sergančio ar imuninio gyvūno serume.

2. Antigenas – gyvų arba žuvusių mikrobų, eritrocitų ar kitų ląstelių suspensija.

3. Izotoninis (0,9%) natrio chlorido tirpalas.

Serodiagnostikos agliutinacijos reakcija naudojama esant vidurių šiltinei ir paratifui (Vidal reakcija), bruceliozei (Wright ir Huddleson reakcijai), tuliaremijai ir kt. Šiuo atveju paciento serumas yra antikūnas, o žinomas mikrobas yra antigenas. Kai nustatomi mikrobai ar kitos ląstelės, jų suspensija veikia kaip antigenas, o žinomas imuninis serumas – kaip antikūnas. Ši reakcija plačiai naudojama diagnozuoti žarnyno infekcijos, kokliušo ir kt.

RA inscenizacijos metodai

Apytikslis RA ant stiklo

Dislokuotas RA

(tūrinis metodas)

Koagliutinacijos reakcija

Išplėstas RA ant stiklo (seridentifikacija)

Agliutinacijos reakcija ant stiklo. Du lašai specifinio (adsorbuoto) serumo ir lašas izotoninio natrio chlorido tirpalo užlašinami ant neriebaus stiklelio. Neadsorbuoti serumai iš anksto praskiedžiami santykiu 1:5 – 1:100. Lašai ant stiklo turi būti užlašinami taip, kad tarp jų būtų atstumas. Kultūra kruopščiai trinama kilpa arba pipete ant stiklinės, po to įlašinama į lašą izotoninio natrio chlorido tirpalo ir vieną iš lašų serumo, maišant kiekvieną, kol susidaro vienalytė suspensija. Serumo lašas be kultūros yra serumo kontrolė.

Dėmesio! Serumo kultūros negalima perkelti į lašelį izotoninio natrio chlorido tirpalo, kuris yra antigeno kontrolė. Reakcija vyksta kambario temperatūroje 1-3 min. Jei serumo kontrolė išlieka skaidri, antigeno kontrolėje stebimas vienodas drumstumas ir skaidraus skysčio fone lašelyje, kuriame kultūra sumaišoma su serumu, atsiranda agliutinato dribsnių, reakcijos rezultatas laikomas teigiamu.

Diagnostinė fiziologinė

serumas + kultūros tirpalas + kultūra

Išplėstinė agliutinacijos reakcija (tūrinis metodas). Serumo skiedimai ruošiami nuosekliais, dažniausiai dvigubais skiedimais. Metodas vadinamas masiniu. Norėdami nustatyti antikūnų titrą kraujo serume, paimkite 6 mėgintuvėlius. Į pirmąjį mėgintuvėlį įpilkite 1 ml pradinio serumo praskiedimo santykiu 1:50 ir graduota pipete į visus 6 mėgintuvėlius įpilkite 1 ml fiziologinio tirpalo. Pirmajame mėgintuvėlyje bus gautas 2 ml tūrio serumo praskiedimas santykiu 1:100. Iš pirmojo mėgintuvėlio 1 ml perpilkite į antrąjį mėgintuvėlį, kur praskiedimas tampa 1:200. Taigi pirmuose 5 mėgintuvėliuose atlikite serijos serumo praskiedimus (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iš penktojo mėgintuvėlio įpilkite 1 ml į dezinfekavimo tirpalą. Į visus 6 mėgintuvėlius įlašinkite 2 lašus diagnostikos. Šeštasis mėgintuvėlis yra kultūros kontrolė, nes jame yra tik fiziologinis tirpalas ir diagnostinė medžiaga.

Tokia kontrolė būtina, kad būtų išvengta spontaniškos kultūros agliutinacijos. Mėgintuvėliai pakratomi ir dedami į termostatą 37°C temperatūroje 2 valandoms, o po to paliekami parai kambario temperatūroje, po to registruojami agliutinacijos reakcijos rezultatai. Nustatant agliutinacijos reakciją su vaikų serumais pirmaisiais gyvenimo mėnesiais, dėl antikūnų susidarymo funkcinio prastumo, būtina nustatyti mažesnius antikūnų titrus, į kuriuos atsižvelgiama skiedžiant serumą. Pradinis serumo praskiedimas yra 1:25. Pirmajame mėgintuvėlyje gaunamas skiedimas 1:50, vėliau 1:100 ir t.t.

Esant teigiamam reakcijos rezultatui, mėgintuvėliuose skaidraus skysčio fone matomos lipnios ląstelės grūdelių ar dribsnių pavidalu. Agliutinatas palaipsniui nusėda į dugną „skėčio“ pavidalu, o virš nuosėdų esantis skystis tampa skaidrus. Antigeno kontrolė yra tolygiai drumsta.

Pagal nuosėdų pobūdį išskiriama smulkiagrūdė ir stambiagrūdė (panaši į dribsnius) agliutinacija. Dirbant su O-serumu gaunama smulkiagrūdė agliutinacija. Stambiagrūdis – judrių mikrobų sąveikos su žvyneliais H serumais metu. Ateina greičiau nei smulkiagrūdis, susidarančios nuosėdos labai birios ir lengvai lūžta.

Reakcijos intensyvumas išreiškiamas taip:

Visos ląstelės nusistovėjo, skystis mėgintuvėlyje yra visiškai skaidrus. Reakcijos rezultatas yra labai teigiamas;

Nuosėdų mažiau, nėra visiško skysčio nušvitimo. Reakcijos rezultatas yra teigiamas;

Nuosėdų dar mažiau, skystis drumstesnis. Reakcijos rezultatas abejotinas;

vamzdelio apačioje yra nežymios nuosėdos, skystis drumzlinas. Abejotinas reakcijos rezultatas;

Nėra nuosėdų, skystis tolygiai drumstas, kaip ir antigeno kontrolėje. Neigiamas rezultatas reakcijos