इम्यूनोब्लोटिंग एचआईवी पॉजिटिव। एचआईवी इम्यूनोब्लॉट के लिए इम्यूनोब्लॉट द्वारा एड्स का निदान कैसे किया जाता है - यह क्या है? संक्रामक रोगों के निदान में इम्युनोब्लॉट

विशिष्ट सुविधाएं:

• अभिकर्मकों के सेट "MPBA - ब्लाट - HIV-1, HIV-2" में HIV 1 और पेप्टाइड - HIV-2 gp36 एंटीजेनिक निर्धारक के शुद्ध लाइसेट वायरल प्रोटीन होते हैं;
• एक पट्टी पर HIV-1, HIV-1 समूह O, HIV 2 को एंटीबॉडी का पता लगाना;
• विश्लेषण तैयार करने और संचालित करने के लिए एक सरल प्रक्रिया;
• प्रतिक्रिया का आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण*
• विश्लेषण की अधिकतम गति (3 घंटे);
• परीक्षण नमूने की एक छोटी मात्रा - 20 μl;
• अनुसंधान के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं है;
• किट की गुणवत्ता की गारंटी रूसी और अंतरराष्ट्रीय मानक नमूनों ** के उपयोग से होती है

* आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण की उपस्थिति से सुनिश्चित किया जाता है:

• आंतरिक नियंत्रण स्ट्रिप्स, सीरम या प्लाज्मा नमूने की शुरूआत का नियंत्रण प्रदान करता है;
• नियंत्रण नकारात्मक सीरम (के-);
• नियंत्रण सकारात्मक सीरम (K+), जो पट्टी पर पाए गए बैंड की पहचान करने की अनुमति देता है;
• कमजोर सकारात्मक सीरम (के + सीएल) को नियंत्रित करें, जो अभिकर्मक किट की संवेदनशीलता को नियंत्रित करता है।

**गुणवत्ता आश्वासन:

MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 अभिकर्मक किट की विशेषताओं का निर्धारण दाताओं के एक यादृच्छिक नमूने के नमूनों के परीक्षण के द्वारा किया गया था, रोगियों के निदान के साथ एचआईवी संक्रमण, वाणिज्यिक सेरोकनवर्जन पैनल, मानक पैनल, और "संभावित रूप से हस्तक्षेप करने वाले" घटकों वाले नमूने।

अभिकर्मक किट मानक पैनल के सेरा के अध्ययन में गलत सकारात्मक परिणाम नहीं देती है जिसमें एचआईवी 1.2 और एचआईवी-1 एंटीजन ("मानक एटी (-) एचआईवी", संख्या एफएसआर 2007/00953 10/ 25/2007)। विशिष्टता - 100%।

विभिन्न रक्त केंद्रों और क्लीनिकों से 200 दाताओं के एक यादृच्छिक नमूने का अध्ययन करके नैदानिक ​​​​विशिष्टता निर्धारित की गई थी, जिसमें एचआईवी -1, एचआईवी -2 संक्रमण की प्रारंभिक पुष्टि की गई थी। दाताओं के यादृच्छिक नमूने के अध्ययन में विशिष्टता 100% थी;

अभिकर्मक किट की विशिष्टता 250 नमूनों के अध्ययन में निर्धारित की गई थी, जिसमें गर्भवती महिलाओं, अस्पताल में भर्ती रोगियों, हेपेटाइटिस सी और ई के रोगियों से प्राप्त सीरम या प्लाज्मा नमूने और "संभावित रूप से हस्तक्षेप करने वाले निर्धारण" घटकों वाले नमूने शामिल थे। MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 किट का उपयोग करते समय, इन नमूनों के लिए कोई गलत-सकारात्मक परिणाम नहीं पाए गए।

नैदानिक ​​​​संवेदनशीलता का उपयोग करके निर्धारित किया गया था:
- बोस्टन बायोमेडिका, इंक। विभिन्न एचआईवी-1 उपप्रकार वाले विभिन्न क्षेत्रों से एचआईवी -1 पैनल प्लाज्मा नमूने (डब्ल्यूडब्ल्यूआरबी 301): समूह एम (उपप्रकार ए, बी, सी, डी, ई, एफ), और समूह ओ; अभिकर्मक किट की संवेदनशीलता 100% थी;

अभिकर्मक किट की संवेदनशीलता अंतरराष्ट्रीय सेरोकनवर्जन पैनल बोस्टन बायोमेडिका, इंक (सेराकेयर लाइफ साइंसेज), बिल्ली के अध्ययन में निर्धारित की गई थी। एनआरएस। पीआरबी 903, पीआरबी 904, पीआरबी 909, पीआरबी 912, पीआरबी 916, पीआरबी 917, पीआरबी 918, पीआरबी 919, पीआरबी 921, पीआरबी 923, पीआरबी 924, पीआरबी 927, पीआरबी 928, पीआरबी 932, पीआरबी 940

अभिकर्मकों की किट एक मानक पैनल के सीरा में एचआईवी-1 के लिए एंटीबॉडी का पता लगाती है जिसमें एचआईवी-1 ("मानक एटी (+) एचआईवी-1", सं. एफएसआर 2007/00953 दिनांक 25 अक्टूबर, 2007), एंटीबॉडी का पता लगाता है। HIV-2 के लिए एंटीबॉडी युक्त मानक पैनल के सीरा में HIV-2 ("मानक AT (+) HIV-2", संख्या FSR 2007/00953 10/25/2007)। संवेदनशीलता - 100%।

पंजीकरण प्रमाणपत्र संख्या एफएसआर 2010/07958 दिनांक 13 जुलाई, 2011 (वैधता सीमित नहीं है)

मिश्रण:

• इम्यूनोसॉर्बेंट। अलग-अलग एचआईवी-1 प्रोटीन (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) के साथ सफेद नाइट्रोसेल्युलोज झिल्ली स्ट्रिप्स उन पर इलेक्ट्रोट्रांसफर की विधि द्वारा सोख ली जाती हैं और एक सिंथेटिक एचआईवी-2 पेप्टाइड के साथ पट्टी पर लागू होती हैं। जीपी36 प्रोटीन और एंटी-आईजीजी मानव (आंतरिक नियंत्रण) का एक एनालॉग - 18 पीसी;
• K- - नकारात्मक सीरम को नियंत्रित करें। मानव रक्त सीरम जिसमें HIV-1,2, HCV, HIV एंटीजन, HBsAg के एंटीबॉडी नहीं होते हैं, 560C पर गर्म करके निष्क्रिय कर दिया जाता है; पारदर्शी हल्का पीला तरल - 1 टेस्ट ट्यूब (0.08 मिली)। परिरक्षक शामिल हैं: थिमेरोसल और सोडियम एजाइड;
• K+ - सकारात्मक सीरम को नियंत्रित करें। मानव रक्त सीरम में एचआईवी-1,2 के एंटीबॉडी होते हैं (टिटर 1:10000 से कम नहीं), जिसमें एचबीएसएजी, एचआईवी एंटीजन, एचसीवी के एंटीबॉडी नहीं होते हैं, 560C पर गर्म करके निष्क्रिय किया जाता है; पारदर्शी हल्का पीला तरल - 1 टेस्ट ट्यूब (0.08 मिली)। इसमें संरक्षक होते हैं: थिमेरोसल और सोडियम एजाइड;
• K+sl - कमजोर सकारात्मक सीरम को नियंत्रित करें। मानव रक्त सीरम में एचआईवी-1,2 के प्रति एंटीबॉडी (टिटर 1:200 से अधिक नहीं), एचबीएसएजी, एचआईवी एंटीजन, एचसीवी के एंटीबॉडी, 560C पर गर्म करके निष्क्रिय; पारदर्शी हल्का पीला तरल - 1 टेस्ट ट्यूब (0.08 मिली)। परिरक्षक शामिल हैं: थिमेरोसल और सोडियम एजाइड;
• RROKk (x10) - नमूनों और संयुग्म के कमजोर पड़ने का समाधान। ध्यान लगाओ - ट्रिस बफर जिसमें पूर्व-उपचारित सामान्य बकरी सीरम होता है; अपारदर्शी ग्रे तरल - 1 शीशी (10 मिली)। परिरक्षक शामिल है: थिमेरोसल;
• PRk (x20) - धुलाई समाधान। ध्यान लगाओ - ट्रिस बफर जिसमें ट्वीन -20 है; स्पष्ट बेरंग तरल - 1 शीशी (70 मिली)। परिरक्षक शामिल है: थिमेरोसल;
• संयुग्म। मानव आईजीजी के लिए बकरी एंटीबॉडी, क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित; स्पष्ट रंगहीन तरल - 1 टेस्ट ट्यूब (0.06 मिली);
• सब्सट्रेट (रंग समाधान)। 5-ब्रोमो-4-फ्लोरो-इंडोलिल-फॉस्फेट (बीसीआईपी) और नाइट्रोसीन टेट्राजोलियम (एनबीटी) का समाधान; पारदर्शी हल्का पीला तरल - 1 शीशी (50 मिली);
• के लिए चूर्ण प्रतिरक्षा धब्बा. स्किम्ड मिल्क पाउडर - अनाकार सफेद या हल्का पीला पाउडर - 5 पैक x 1g;
• प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए ढक्कन वाला एक टैबलेट - 2 टुकड़े;
• प्लास्टिक चिमटी - 1 टुकड़ा।

इम्यूनोब्लॉटिंग -(अंग्रेजी "ब्लाट" - स्पॉट से) - ज्ञात सीरा (या एंटीजन) का उपयोग करके एंटीजन (या एंटीबॉडी) की पहचान करने की एक विधि। यह एलिसा के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन का एक संयोजन है। प्रारंभ में, जीवाणु कोशिकाओं या विषाणुओं को अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके नष्ट कर दिया जाता है, और फिर वायरस या जीवाणु कोशिकाओं के सभी प्रतिजनों को वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है और एक विशेष नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्म पर एक वाणिज्यिक अभिकर्मक प्राप्त किया जाता है। इम्युनोब्लॉटिंग की स्थापना करते समय, रोगी के परीक्षण सीरम को ज्ञात एंटीजन वाली फिल्म पर लागू किया जाता है। ऊष्मायन और अनबाउंड एंटीबॉडी की धुलाई के बाद, वे एलिसा के लिए आगे बढ़ते हैं - मानव इम्युनोग्लोबुलिन के लिए एक एंटीसेरम जिसे एक एंजाइम और एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के साथ लेबल किया जाता है जो एंजाइम के साथ बातचीत करते समय रंग बदलता है, फिल्म पर लागू होता है। एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटीसेरम से इम्युनोग्लोबुलिन-एंजाइम कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति में, वाहक पर रंगीन धब्बे दिखाई देते हैं। इम्युनोब्लॉटिंग की विधि आपको रोगज़नक़ के विभिन्न एंटीजन के लिए अलग से एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण में, इम्युनोब्लॉटिंग एंटीबॉडी को gp120, gp24 और वायरस के अन्य एंटीजन का पता लगाता है)।

Radioimmunoassay (आरआईए)

विधि एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पर आधारित है जो एक रेडियोन्यूक्लाइड के साथ एंटीजन या एंटीबॉडी लेबल का उपयोग करती है। 125I, 14C, 3H, 51Cr और अन्य रेडियोन्यूक्लाइड्स को एक लेबल के रूप में उपयोग किया जाता है। परिणामी प्रतिरक्षा परिसरों को सिस्टम से अलग किया जाता है और उनकी रेडियोधर्मिता काउंटरों (बीटा-विकिरण) पर निर्धारित की जाती है। विकिरण की तीव्रता बाध्य एंटीजन और एंटीबॉडी अणुओं की संख्या के सीधे आनुपातिक है।

पॉलीस्टीरिन पैनल के कुओं में लेबल किए गए एंटीबॉडी या एंटीजन का उपयोग करके आरआईए का ठोस-चरण संस्करण व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

RIA का उपयोग रोगाणुओं, वायरस, विभिन्न हार्मोन, एंजाइमों के एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है। औषधीय पदार्थ, इम्युनोग्लोबुलिन, साथ ही 10-12–10-15 g/l की मामूली सांद्रता में परीक्षण सामग्री में निहित अन्य पदार्थ।

प्रश्नों पर नियंत्रण रखें

इम्यून बैक्टीरियोलिसिस प्रतिक्रिया: यह किस प्रकार की प्रतिक्रिया है; एंटीजन क्या है, एंटीबॉडी क्या है, प्रतिक्रिया तंत्र, सेटिंग के तरीके, व्यावहारिक अनुप्रयोग। प्रतिरक्षा हेमोलिसिस प्रतिक्रिया: आवश्यक सामग्री, सेटिंग की विधि; नियंत्रण, व्यावहारिक अनुप्रयोग। जेल में स्थानीय हेमोलिसिस की प्रतिक्रिया (येर्न प्रतिक्रिया): प्रतिक्रिया का सिद्धांत, निर्माण की विधि, व्यावहारिक अनुप्रयोग। पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया: प्रतिक्रिया सिद्धांत; जब प्रतिरक्षा सीरम एक विशिष्ट प्रतिजन के साथ संपर्क करता है तो क्या बनता है; यदि यह इस अंतःक्रिया में मौजूद है तो इसका पूरक क्या होगा? प्रतिजन और एंटीबॉडी के बीच कोई विशिष्ट संबंध नहीं होने पर पूरक का भाग्य क्या है? पूरक के साथ क्या हुआ यह निर्धारित करने के लिए किस प्रतिक्रिया का उपयोग किया जा सकता है; इस प्रतिक्रिया का उपयोग क्यों किया जाता है; क्या दिख रहा है सकारात्मक परिणामआरएसके? क्यों? सीएससी के पहले चरण में पूरक के किस गुण का उपयोग किया जाता है? दूसरे चरण में? यदि आरएसके का अंतिम परिणाम हेमोलिसिस है, तो इसका क्या अर्थ है - सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम? परिणामों की व्याख्या करें: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+। पहले RSK सिस्टम के अवयवों और दूसरे RSK सिस्टम के अवयवों के नाम बताइए। टेस्ट सीरम को निष्क्रिय करने की आवश्यकता क्यों है? पूरक का शीर्षक कैसे दिया जाता है? हेमोलिटिक सीरम: इसमें क्या होता है, इसे कैसे प्राप्त किया जाता है, टिटर क्या होता है और यह कैसे निर्धारित किया जाता है? आरएससी घटकों को प्राप्त करने के लिए किन जानवरों का उपयोग किया जाता है? ठंड में आरएससी लगाने की तकनीक। निम्नलिखित में से किस प्रतिक्रिया का मंचन करते समय, एक पूरक की भागीदारी आवश्यक है: वर्षा, फ्लोक्यूलेशन, एग्लूटीनेशन, अपूर्ण एंटीबॉडी का पता लगाना, प्रतिरक्षा बैक्टीरियोलिसिस, प्रतिरक्षा हेमोलिसिस, जेर्न, सीएससी? इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (आरआईएफ) - प्रत्यक्ष कून प्रतिक्रिया में घटनाओं के अनुक्रम को इंगित करें; आवश्यक सामग्री। एंटीजन क्या है, एंटीबॉडी क्या है, एंटीबॉडी का लेबल कैसे लगाया जाता है, प्रतिक्रिया के परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है, सकारात्मक परिणाम कैसा दिखता है? व्यावहारिक अनुप्रयोग - इस प्रतिक्रिया का उपयोग करके क्या निर्धारित किया जा सकता है? अप्रत्यक्ष प्रतिक्रियाइम्यूनोफ्लोरेसेंस - इस प्रतिक्रिया में घटनाओं के क्रम को इंगित करें, आवश्यक सामग्री, एंटीजन क्या है, प्रतिरक्षा सेरा क्या उपयोग किया जाता है; प्रायोगिक उपयोग; प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया पर अप्रत्यक्ष आरआईएफ का लाभ। एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा) - प्रतिक्रिया का सिद्धांत; आवश्यक सामग्री; परीक्षण सामग्री में एंटीजन का पता लगाने के लिए प्रतिक्रिया स्थापित करते समय घटनाओं के अनुक्रम को इंगित करें; आवश्यक सामग्री; सकारात्मक परिणाम से क्या होता है, यह कैसा दिखता है? परीक्षण सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एलिसा के दौरान क्रियाओं का क्रम निर्दिष्ट करें; आवश्यक सामग्री; सकारात्मक परिणाम से क्या होता है? इम्यूनोब्लोटिंग - प्रतिक्रिया का सिद्धांत; मुख्य चरण; आवश्यक सामग्री; परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है? प्रतिक्रिया लाभ। Radioimmunoassay (RIA) - प्रतिक्रिया के मुख्य चरण क्या हैं; एंटीबॉडी या एंटीजन किसके साथ लेबल किए जाते हैं, परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है? इम्युनो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी- विधि का सिद्धांत; मुख्य चरण; आवश्यक सामग्री; एंटीबॉडी किसके साथ लेबल किए जाते हैं? प्रतिक्रिया के परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है। स्थिरीकरण प्रतिक्रियाएं - विधि का सिद्धांत, सेटिंग की तकनीक, घटक, परिणामों के लिए लेखांकन।

स्व-प्रशिक्षण की प्रक्रिया में प्रदर्शन करने के लिए कार्य।

इस विषय में शामिल प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तालिका को पूरा करें।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं

एक व्यावहारिक पाठ में छात्र का काम

आरएससी के पहले चरण के निर्माण के साथ तुरंत काम शुरू करें, लेकिन इसे बाद में एक नोटबुक में लिख लें (नीचे देखें)।

1. प्रतिरक्षा हेमोलिसिस की प्रतिक्रिया। प्रतिरक्षा हेमोलिसिस की एक प्रदर्शन प्रतिक्रिया देखें, इसे आरेख के रूप में बनाएं, प्रयोगात्मक और नियंत्रण ट्यूबों में परिणाम की व्याख्या करें।

2. पूरक बाध्यकारी प्रतिक्रिया

ए) तालिका के अनुसार आरएससी को अलग करें;

बी) तालिका के रूप में आरएससी सेट करने के लिए एक नोटबुक में एक योजना बनाएं;

ग) आरएसके का दूसरा चरण रखें (पहला चरण पाठ की शुरुआत में रखा गया है);

डी) आरएसके के लिए आवश्यक नैदानिक ​​​​तैयारियों को अलग करना;

ई) परिणाम को ध्यान में रखें। परीक्षण सीरम में विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति के बारे में एक निष्कर्ष तैयार करें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया। तालिका का अध्ययन करें, अपनी नोटबुक में प्रतिक्रिया की स्थापना के लिए एक योजना बनाएं; डायग्नोस्टिक सीरा देखें; निर्धारित करें कि सीरम में क्या है, इसे कैसे तैयार किया जाता है, किस प्रतिक्रिया (प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष आरआईएफ) के लिए इसका उपयोग किया जाता है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में RIF के प्रदर्शन परिणाम को देखें।

4. एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा)। अपनी नोटबुक में, दो संस्करणों में एक प्रतिक्रिया योजना तैयार करें: परीक्षण सामग्री में एंटीजन का पता लगाने के लिए और सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए। एचआईवी और हेपेटाइटिस बी डायग्नोसिस संघटक किट की समीक्षा करें। निर्धारित करें कि प्रत्येक घटक में क्या है और इसका उपयोग किस लिए किया जाता है।

5. इम्यूनोब्लॉटिंग। अपनी नोटबुक में अभिक्रिया का आरेख बनाइए; डेमो देखें - प्रतिक्रिया का परिणाम।

6. रेडियोइम्युनोएसे (आरआईए)। अपनी नोटबुक में प्रतिक्रिया योजना बनाएं।

7. इम्यून इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम)। प्रदर्शन देखें - प्रतिक्रिया का परिणाम, अपनी नोटबुक में एक प्रतिक्रिया योजना बनाएं, एंटीजन (वायरस) और लेबल वाले एंटीबॉडी को तीरों से इंगित करें।

इम्यूनोब्लोटिंग वैद्युतकणसंचलन और एलिसा या आरआईए के संयोजन पर आधारित एक अत्यधिक संवेदनशील प्रोटीन का पता लगाने की विधि है। इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग किया जाता है निदान विधिएचआईवी संक्रमण के साथ, आदि।

एक सामान्य अर्थ में, इम्युनोब्लॉटिंग को एक ठोस समर्थन-झिल्ली में स्थानांतरित प्रोटीन के मिश्रण के विश्लेषण के रूप में समझा जाता है, जिसके साथ वे सहसंयोजक बंधनों से बंधते हैं, जिसके बाद इम्यूनोडेटेक्शन होता है।

एक सब्सट्रेट (डॉट ब्लॉट विश्लेषण) पर सीधे जमा प्रोटीन के मिश्रण का विश्लेषण करना संभव है या इलेक्ट्रोफोकसिंग, डिस्क वैद्युतकणसंचलन, या द्वि-आयामी वैद्युतकणसंचलन (पश्चिमी सोख्ता) द्वारा प्रारंभिक विभाजन के बाद।

रोगज़नक़ एंटीजन को पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है, फिर जेल से सक्रिय पेपर या नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है और एलिसा द्वारा विकसित किया जाता है।

फर्म एंटीजन के "धब्बे" के साथ ऐसी स्ट्रिप्स का उत्पादन करती हैं। इन पट्टियों पर रोगी का सीरम लगाया जाता है। . फिर, ऊष्मायन के बाद, रोगी के अनबाउंड एंटीबॉडी से रोगी को धोया जाता है और एंजाइम के साथ लेबल किए गए मानव इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ सीरम लगाया जाता है। . पट्टी पर बने परिसर (एंटीजन + रोगी के एंटीबॉडी + मानव आईजी के खिलाफ एंटीबॉडी) को एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जोड़कर पता लगाया जाता है जो एंजाइम की क्रिया के तहत रंग बदलता है।

यह पद्धति लक्ष्य क्लोन जीन के उत्पादों को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया, फेज या वायरस के क्लोन के चयन पर भी लागू होती है।

झिल्ली में प्रोटीन का स्थानांतरण या तो निष्क्रिय रूप से या इलेक्ट्रोट्रांसफर तंत्र का उपयोग करके किया जाता है। झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरण की दक्षता कई कारकों से प्रभावित होती है, जैसे कि प्रोटीन का आणविक भार, जेल की सरंध्रता, स्थानांतरण का समय और उपयोग किए गए बफर समाधान (ट्रांस बफर) की संरचना।

प्रयोग के कार्यों और शर्तों के आधार पर, सर्वोत्तम परिणाम प्रदान करने वाली स्थानांतरण स्थितियों का चयन किया जाता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले सबस्ट्रेट्स नाइट्रोसेल्युलोज, पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लुओराइड (पीवीडीएफ), या सकारात्मक चार्ज नायलॉन झिल्ली हैं। Nitrocellulose प्रति 1 सेमी 2 प्रोटीन के 80-100 माइक्रोग्राम तक बांध सकता है।

धुलाई के परिणामस्वरूप कम आणविक भार प्रोटीन (20 kDa से कम आणविक भार के साथ) खो सकते हैं, जो संबंधित प्रतिबंध डीएनए अंशों की लंबाई से कुछ आनुवंशिक लोकी के बहुरूपता का प्रारंभिक अध्ययन करना संभव बनाता है।

इसके अलावा, दक्षिणी संकरण का उपयोग करके, यह पता लगाना आसान है कि क्या लक्ष्य जीन के आंतरिक भाग में एक निश्चित प्रतिबंध एंजाइम द्वारा हाइड्रोलिसिस की साइट है, जो आपको अध्ययन के तहत जीनोम के क्षेत्र की क्लोनिंग के लिए इष्टतम रणनीति चुनने की अनुमति देता है।

इसी तरह की योजना के अनुसार, आरएनए अणुओं को एग्रोज जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर में भी स्थानांतरित किया जा सकता है। इस पद्धति को दक्षिणी सोख्ता के विपरीत उत्तरी सोख्ता कहा जाता है, क्योंकि उपनाम दक्षिणी में अंग्रेजी भाषाका अर्थ है "दक्षिणी"।

तदनुसार प्रोटीन जेल से फिल्टर में स्थानांतरण को वेस्टर्न ब्लॉटिंग कहा जाता था। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) घोल में बड़े प्रोटीन (100 केडीए से अधिक) को खराब तरीके से झिल्ली में स्थानांतरित किया जा सकता है यदि इथेनॉल ट्रांस बफर में मौजूद है। अल्कोहल SDS-polyacrylamide जेल से प्रोटीन के हस्तांतरण में काफी सुधार करता है, लेकिन जेल में छिद्रों को संकरा कर देता है, जिससे बड़े प्रोटीन की अवधारण होती है।

पीवीडीएफ झिल्ली इम्यूनोडिटेक्शन के लिए अनुकूलित है और गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के बहुत कम स्तर के साथ 160 μg/cm2 तक विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन को बनाए रखने में सक्षम है।

immunoblotting

इस झिल्ली की एक महत्वपूर्ण संपत्ति इसके बार-बार उपयोग की संभावना है। ज़ेटा-प्रोब नायलॉन झिल्ली शराब की अनुपस्थिति में एसडीएस प्रोटीन को प्रभावी ढंग से बाँधती है, और यह बंधन बाद के उपचारों के लिए प्रतिरोधी है। कम आणविक भार प्रोटीन भी प्रभावी ढंग से बनाए रखा जाता है। प्रति 1 सेमी2 लगभग 480 μg प्रोटीन की उच्च बाध्यकारी क्षमता के साथ, जीटा-प्रोब झिल्ली परख मिश्रण में प्रोटीन की ट्रेस मात्रा का पता लगाने की अनुमति देती है।

झिल्ली पर प्रतिजन के स्थिर होने के बाद, शेष बाध्यकारी साइटों को जिलेटिन, या गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, या स्किम दूध के घोल से अवरुद्ध कर दिया जाता है।

फिर झिल्ली को परीक्षण किए गए प्रतिजन के पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के घोल में डाला जाता है। अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के बाद, झिल्ली को द्वितीयक एंटीबॉडी के घोल में डाला जाता है, जो क्षारीय फॉस्फेट एंजाइम (क्षारीय फॉस्फेट, एपी) या हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के संयुग्म होते हैं, जो एंटी-प्रजाति एंटीबॉडी (खरगोश, माउस या बकरी एंटीबॉडी) के साथ होते हैं। मानव इम्युनोग्लोबुलिन) या प्रोटीन ए (स्टैफिलोकोकस ऑरियस प्रोटीन) या जी (स्ट्रेप्टोकोकस एसपी। प्रोटीन) इम्युनोग्लोबुलिन के एफसी क्षेत्र के लिए उच्च संबंध रखते हैं।

गठित प्रतिरक्षा परिसरों का पता रासायनिक या रसायनयुक्त विधि द्वारा किया जाता है। के लिए सब्सट्रेट रासायनिक प्रतिक्रियाक्षारीय फॉस्फेट संयुग्मों का उपयोग करते समय, 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (BCIP) या टेट्राजोलियम ब्लू (NBT) का उपयोग करें, और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज संयुग्मों का उपयोग करते समय, 4-क्लोरो-1-नेफ्थॉल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करें।

एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप, एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के स्थानीयकरण के स्थल पर झिल्ली पर एक रंगीन बैंड या स्पॉट बनता है।

एपी संयुग्मों का उपयोग करते समय और एचआरपी संयुग्मों का उपयोग करते समय 100-500 पीजी का उपयोग करते समय इस विधि की संवेदनशीलता 100 पीजी प्रोटीन है। प्रतिरक्षा परिसरों के रासायनिक संदीप्ति का पता लगाने से एंटीजन के 5 पीजी से कम का पता लगाया जा सकता है। इस पद्धति का सिद्धांत यह है कि जब HRP हाइड्रोजन पेरोक्साइड और चक्रीय डाइसिलहाइड्राज़ीनेलुमिनोल के साथ प्रतिक्रिया करता है, तो प्रकाश 428 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित होता है, जिसे एक सहज फिल्म पर रिकॉर्ड किया जा सकता है।

इम्युनोब्लॉटिंग रिएक्शन (RI) एलिसा के आधार पर विकसित किया गया था। यह इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण का सबसे विशिष्ट और संवेदनशील तरीका है। इम्युनोब्लॉटिंग (अंग्रेजी ब्लॉट से - गीले होने के लिए, स्पॉट) एलिसा को वैद्युतकणसंचलन के साथ जोड़ती है। इसका उपयोग एचआईवी के लिए जटिल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए नहीं किया जाता है, बल्कि इसके व्यक्तिगत संरचनात्मक प्रोटीन (प्रोटीन-p24, ग्लाइकोप्रोटीन-gp120, gp 41, आदि) के एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जाता है। एचआईवी संक्रमण के निदान के लिए विशेषज्ञ (पुष्टिकारक) प्रतिक्रियाओं का संदर्भ लें।

प्रतिक्रिया कई चरणों में की जाती है:

वायरस घटकों में नष्ट हो जाता है - एंटीजन (p24, gp120, gp 41, आदि), जो एक पॉलीएक्रिलामाइड जेल में वैद्युतकणसंचलन के अधीन होते हैं, अर्थात एंटीजन को आणविक भार द्वारा अंशों में अलग किया जाता है।

2. जेल एक नाइट्रोसेल्युलोज झिल्ली से ढका होता है और एंटीजन अंशों को वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से इसमें स्थानांतरित किया जाता है। नाइट्रोसेल्युलोज सोख्ता कागज की तरह व्यवहार करता है। झिल्ली को स्ट्रिप्स (स्ट्रिप्स) में काटा जाता है। फर्म एंटीजन के "धब्बे" के साथ ऐसी स्ट्रिप्स का उत्पादन करती हैं।

इम्यूनोब्लोटिंग - एक अतिरिक्त अप्रत्यक्ष विधि

उस पर लागू एचआईवी एंटीजन वाली स्ट्रिप्स को विषय के सीरम में डुबोया जाता है और फिर अनबाउंड सामग्री से धोया जाता है।

4. स्ट्रिप्स को पेरोक्सीडेज-लेबल एंटीग्लोबुलिन सीरम के साथ डाला जाता है और धोया जाता है।

एक सब्सट्रेट जोड़ा जाता है और रंगीन अंशों (धब्बों) की संख्या नोट की जाती है, जो एजी-एटी परिसर के स्थानीयकरण क्षेत्र के अनुरूप होती है।

पट्टी के कुछ क्षेत्रों में धारियों की उपस्थिति सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी के अध्ययन किए गए सीरम में उपस्थिति की पुष्टि करती है। इम्युनोब्लॉटिंग का परिणाम सकारात्मक माना जाता है यदि तीन एचआईवी एंटीजन - p24, gp41 और gp 120 में से किन्हीं दो के अनुरूप बैंड झिल्ली पर दिखाई देते हैं (चित्र 37)।

चित्र

प्रयुक्त साहित्य की सूची

मुख्य साहित्य

मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी, वायरोलॉजी और इम्यूनोलॉजी: मेडिकल छात्रों के लिए एक पाठ्यपुस्तक। विश्वविद्यालयों द्वितीय संस्करण।, सही किया गया। और अतिरिक्त - 702 पी। ईडी। ए.ए. वोरोब्योव। एम. : एमआईए, 2012।

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अतिरिक्त साहित्य

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इम्यूनोब्लॉट - यह क्या है? संक्रामक रोगों के निदान में इम्युनोब्लॉट

एक इम्युनोब्लॉट क्या है? यह एक सामान्य प्रयोगशाला निदान पद्धति है। विषाणु संक्रमणव्यक्ति। यह एचआईवी की उपस्थिति का पता लगाने के सबसे सटीक और विश्वसनीय तरीकों में से एक है।

विश्वसनीयता के लिए, यह एंजाइम-युग्मित इम्युनोसॉरबेंट (एलिसा) परख से भी बड़ा है। इम्युनोब्लॉट परिणामों को निर्णायक और निर्णायक माना जाता है। सामान्य जानकारी

इम्यूनोब्लॉट - यह क्या है? किसी व्यक्ति को एचआईवी पॉजिटिव के रूप में पहचानने के लिए, आपको रक्त सीरम में एंटीबॉडी की उपस्थिति के परीक्षण के लिए प्रयोगशाला परीक्षण से गुजरना होगा।

पश्चिमी धब्बा वर्गों की विधि को पश्चिमी धब्बा (पश्चिमी धब्बा) भी कहा जाता है। यह एक अतिरिक्त विशेषज्ञ विधि के रूप में मानव वायरल संक्रमणों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। एलिसा की पुष्टि करने के लिए यह आवश्यक है - एक प्रयोगशाला परीक्षण जो आपको रक्त में एचआईवी के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। इम्युनोब्लॉट पॉजिटिव एलिसा की दोबारा जांच करता है।

यह सबसे संवेदनशील, जटिल और महंगी मानी जाती है।

लक्ष्य

एक इम्युनोब्लॉट क्या है? वायरस के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए रक्त सीरम के प्रयोगशाला परीक्षण की यह विधि।

जेल में और नाइट्रोसेल्युलोज झिल्लियों पर कुल वायरल प्रोटीन के विशेष अध्ययन के दौरान।

इम्युनोब्लोटिंग (कुछ रोगज़नक़ प्रतिजनों के लिए रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी का पता लगाना)

वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शन प्रक्रिया का उद्देश्य एचआईवी संक्रमण को निर्धारित करना है विभिन्न चरण. पहले चरण में, इसके घटक भागों से शुद्ध वायरस को वैद्युतकणसंचलन और इसमें शामिल एंटीजन को आणविक भार से विभाजित किया जाता है।

मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस अपनी आनुवंशिक जानकारी में सन्निहित जीवित कोशिकाओं में प्रतिकृति बनाता है। इस स्तर पर, यदि आप संक्रमित हो गए हैं तो व्यक्ति एचआईवी वायरस का वाहक बन जाता है।

इस रोग की विशिष्टता यह है कि यह कब काप्रकट नहीं होता है। वायरस लिम्फोसाइटों को नष्ट कर देता है, इस प्रकार, एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा कम हो जाती है और शरीर संक्रमणों से लड़ने में असमर्थ हो जाता है।

यदि एचआईवी का सही ढंग से और समय पर इलाज किया जाता है, तो रोगी वृद्धावस्था तक जीवित रहेगा। उपचार की कमी अनिवार्य रूप से मृत्यु की ओर ले जाती है। संक्रमण के क्षण से, लेकिन उपचार के बिना, अधिकतम अवधि दस वर्ष से अधिक नहीं है।

peculiarities

इम्युनोब्लॉट विश्लेषण एक विश्वसनीय तरीका है जो आपको पहले और दूसरे प्रकार के एचआईवी एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है।

यदि कोई व्यक्ति संक्रमित होता है, तो दो सप्ताह के एंटीबॉडी के बाद, जिसका पता बहुत बाद में लगाया जा सकता है। एचआईवी की एक विशेषता यह है कि एंटीबॉडी की मात्रा तेजी से बढ़ती है और रोगी के रक्त में बनी रहती है। यहां तक ​​कि अगर वे मौजूद हैं, तो रोग दो या अधिक वर्षों तक प्रकट नहीं हो सकता है। एलिसा विधि हमेशा रोग की उपस्थिति का सटीक संकेत नहीं देती है, यदि एंजाइम इम्यूनोएसे ने सकारात्मक परिणाम दिखाया है, तो पीसीआर और पश्चिमी धब्बा वर्गों से परिणामों की पुष्टि की आवश्यकता होती है।

के लिए संकेत

किस प्रकार का "इम्युनोब्लॉट" पहले ही पाया जा चुका है, लेकिन जिसे अध्ययन में पेश किया जा रहा है?

मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) इम्युनोब्लॉट के परीक्षण का कारण एक सकारात्मक एलिसा परिणाम होगा। उन रोगियों में एक एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख से गुजरना आवश्यक है जो सर्जरी से गुजरने वाले हैं। इसके अलावा, आपको गर्भावस्था की योजना बनाने वाली महिलाओं के साथ-साथ स्वच्छंद महिलाओं का भी विश्लेषण करना चाहिए। यदि एलिसा के परिणाम संदिग्ध हैं तो एचआईवी संक्रमण वाले रोगियों को वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शन दिए जाते हैं।

निम्नलिखित खतरनाक लक्षण एक डॉक्टर को देखने का एक कारण हो सकते हैं: तेजी से वजन कम होना; कमजोरी, कार्य में कमी; आंत्र विकार (दस्त) जो तीन सप्ताह तक रहता है; निर्जलीकरण; बुखार; बढ़ा हुआ लसीकापर्वशरीर में; कैंडिडिआसिस, तपेदिक, निमोनिया, टोक्सोप्लाज़मोसिज़, दाद की तीव्रता का विकास।

रोगी को लेने से पहले तैयारी करने की आवश्यकता नहीं है नसयुक्त रक्त.

परीक्षण से 8-10 घंटे पहले कुछ न खाएं। रक्तदान से एक दिन पहले उत्साह का अनुभव करने के लिए शराब और कॉफी पीने, भारी शारीरिक व्यायाम करने की सिफारिश नहीं की जाती है।

विश्लेषण कहाँ करना है?

मैं एचआईवी के लिए परीक्षण कहां करवा सकता हूं?

एलिसा, शहरी निजी क्लीनिकों में किया गया एक इम्युनोब्लॉट विश्लेषण, एक दिन के भीतर परिणाम देता है। तत्काल निदान भी संभव है। रूसी संघ के कानून के अनुसार, सार्वजनिक संस्थानों में, एलिसा चिकित्सा परीक्षण और वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शन निःशुल्क हैं।

गर्भवती महिलाओं के संक्रामक रोगों और अस्पताल में भर्ती या सर्जरी की आवश्यकता वाले रोगियों के लिए अनिवार्य जांच। यह अध्ययन कैसे किया जाता है?

एलिसा का संचालन कैसे करें? इम्युनोब्लॉट सकारात्मक/नकारात्मक एलिसा परिणामों की पुष्टि या खंडन करता है। प्रक्रिया काफी सरल है। विशेषज्ञ शिरापरक रक्त लेता है, इसमें पांच मिनट से भी कम समय लगता है।

नमूना लेने के बाद, इंजेक्शन साइट को कीटाणुरहित किया जाना चाहिए और प्लास्टर से सील कर दिया जाना चाहिए। नमूना खाली पेट लिया जाता है, इसलिए प्रक्रिया के बाद डार्क चॉकलेट या एक मीठा गर्म पेय खाने से चोट नहीं लगती है।

एक सार्वजनिक चिकित्सा संस्थान में एक नि: शुल्क विश्लेषण के लिए रेफरल प्राप्त करने के लिए, आपको एक चिकित्सक से मिलना चाहिए।

सामान्य तौर पर, इम्युनोब्लॉट नमूनाकरण द्वारा अन्य रक्त परीक्षणों से भिन्न नहीं होता है। अनुसंधान पद्धति सरल है। यदि किसी व्यक्ति के रक्त में वायरस मौजूद होता है, तो शरीर उसे नष्ट करने के लिए एंटीबॉडी का उत्पादन शुरू कर देता है। प्रत्येक वायरस के लिए कई प्रोटीन एंटीजन होते हैं। इन एंटीबॉडी का पता लगाना वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शनिंग पद्धति का आधार है। कीमत

कितना विश्लेषण? इम्यूनोब्लॉट एचआईवी सस्ते शोध को संदर्भित करता है।

औसतन, स्क्रीनिंग इम्यूनोसे तरीके 500 से 900 रूबल तक होते हैं। वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शन एक स्टडी चेक है, जिसकी कीमत तीन से पांच हजार रूबल तक होती है। अधिक जटिल तरीके बहुत अधिक महंगे हैं। उदाहरण के लिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के विश्लेषण के लिए आपको लगभग 12,000 रूबल का भुगतान करना होगा।

परिणामों की व्याख्या

एचआईवी संक्रमण के निदान के लिए सबसे आम तरीके एंजाइम इम्यूनोएसे और इम्युनोब्लॉट हैं।

वे मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस के सीरम एंटीबॉडी के निर्धारण के लिए हैं। संक्रमण की पुष्टि आमतौर पर दो परीक्षणों द्वारा की जाती है: स्क्रीनिंग और पुष्टिकरण। परिणामों की व्याख्या डॉक्टर द्वारा की जानी चाहिए, वह उपचार का निदान और निर्धारित करता है। यदि इम्युनोब्लॉट पॉजिटिव है, तो इसका मतलब है मानव शरीरवाइरस।

एक सकारात्मक परिणाम स्व-उपचार का कारण नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक रोगी के पास रोग की अपनी तस्वीर हो सकती है।

गुणात्मक विश्लेषण में स्क्रीनिंग और प्रमाणन शामिल है। यदि रोगी में वायरस नहीं है, तो परिणाम "नकारात्मक" होता है। जब यह प्रमाणपत्र मिल जाता है, तो अतिरिक्त स्क्रीनिंग टेस्ट किए जाते हैं। इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण जो स्क्रीनिंग की पुष्टि या खंडन करता है। यदि परीक्षण स्ट्रिप्स कुछ क्षेत्रों (प्रोटीन स्थानीयकरण) के अंधेरे में दिखाई देते हैं, तो निदान "एचआईवी" है।

यदि परिणाम संदिग्ध हैं, तो परीक्षण तीन महीने के भीतर किए जाते हैं।

ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस के संक्रमण को रोकने के लिए कुछ नियमों का पालन करना संभव है: आकस्मिक यौन संपर्क से बचें, संपर्क के दौरान कंडोम का उपयोग करें, दवाओं का उपयोग न करें।

यदि गर्भवती महिला में बीमारी का पता चला है, तो उपस्थित चिकित्सक की सिफारिशों का पालन करना महत्वपूर्ण है, वायरस की उपस्थिति के लिए परीक्षणों को न भूलें।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग क्या है?

जटिल मिश्रण या विभिन्न ऊतकों के अर्क में प्रोटीन की पहचान अक्सर सामने आने वाली समस्याओं में से एक है। विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में इस तरह के एक उपकरण का उपयोग करके, न्यूनतम समय और वित्तीय लागतों के साथ अध्ययन के तहत प्रोटीन का निर्धारण करना संभव है।

पश्चिमी सोख्ता विधि में, पहले चरण में, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की उपस्थिति में वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन का मिश्रण अलग किया जाता है, फिर इलेक्ट्रोब्लॉटिंग द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है।

इस पद्धति का सार इस तथ्य में निहित है कि वैद्युतकणसंचलन के बाद जेल को फिल्टर पेपर की परतों के बीच नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर रखा जाता है। इस तरह से इकट्ठे हुए "सैंडविच" को एक विद्युत क्षेत्र में रखा जाता है ताकि प्रोटीन-एसडीएस परिसरों को जेल प्लेट में स्थानांतरित किया जा सके और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली की सतह पर स्थिर (अविशिष्ट सोरशन के परिणामस्वरूप) हो।

नाइट्रोसेल्युलोज झिल्ली के लिए प्रोटीन-एसडीएस कॉम्प्लेक्स के बंधन में, मुख्य रूप से विद्युत बल शामिल होते हैं, और यह अंतःक्रिया बहुस्तरीय होती है और झिल्ली की सतह पर प्रोटीन के "प्रसार" की ओर ले जाती है। इस प्रकार, इलेक्ट्रोट्रांसफर के बाद, हम नाइट्रोसेल्युलोज पर जेल की एक प्रतिकृति प्राप्त करते हैं, जिसमें प्रोटीन उसी तरह व्यवस्थित होता है जैसे कि पॉलीएक्रिलामाइड जेल में होता है।

एसडीएस के बाद - वैद्युतकणसंचलन, इलेक्ट्रोट्रांसफर और जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर प्रोटीन का सोखना, प्रोटीन की तृतीयक रचना बहुत बदल जाती है, अगर इस तरह के कठोर उपचार के बाद प्रोटीन के लिए तृतीयक संरचना के अस्तित्व की बात करना आम तौर पर सही है . इसलिए, अध्ययन के तहत प्रोटीन के इम्यूनोकेमिकल डिटेक्शन के लिए, आमतौर पर प्रोटीन अणु के रैखिक क्षेत्रों के लिए विशिष्ट मोनो- या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।

51. एंजाइम इम्यूनोएसे, इम्यूनोब्लॉटिंग। तंत्र, घटक, अनुप्रयोग।

कंफॉर्मल एपिटोप्स (या इंटरसबयूनिट कॉन्टैक्ट्स वाली साइट्स) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी आमतौर पर वेस्टर्न ब्लॉट विधि में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

प्रोटीन हस्तांतरण के बाद, झिल्ली को अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ क्रमिक रूप से ऊष्मायन किया जाता है, और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी के एफसी अंशों के लिए विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ, एक एंजाइम (या कुछ अन्य) लेबल (छवि 1) के साथ संयुग्मित होता है।

1 ए)। मामले में जब अध्ययन किए गए प्रतिजन के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे लेबल के साथ संयुग्मित होते हैं, तो द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है (चित्र 1 बी)। अध्ययन किए गए प्रोटीन स्थानीयकरण की साइट पर बनने वाले प्रतिरक्षा परिसरों को एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट (लेबल के प्रकार के आधार पर) की मदद से "प्रकट" किया जाता है।

विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता अत्यधिक निर्भर है जिस पर अध्ययन में एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।

उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी केवल अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक अद्वितीय अमीनो एसिड अनुक्रम के लिए विशिष्ट होने चाहिए। अन्यथा, कई प्रोटीन अणुओं के साथ एंटीबॉडी की बातचीत (विशेष रूप से मोटे प्रोटीन अर्क के मामले में) संभव है, जो बदले में झिल्ली पर कई रंगीन बैंडों की उपस्थिति को जन्म देगा।

इस मामले में अध्ययन के तहत प्रोटीन की पहचान करना अक्सर मुश्किल या असंभव भी होता है।

एंटीबॉडी चुनते समय ध्यान में रखने वाला दूसरा महत्वपूर्ण कारक आत्मीयता है। उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी की आत्मीयता जितनी अधिक होगी, प्रोटीन बैंड का दाग उतना ही तेज और साफ होगा, विधि की संवेदनशीलता उतनी ही अधिक होगी। उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, 1 एनजी और इससे भी अधिक की संवेदनशीलता प्राप्त की जा सकती है।

झिल्ली-बाध्य प्रतिजन और एंटीबॉडी के संपर्क के परिणाम की कल्पना करने के लिए, कुछ शर्तों के तहत एक निश्चित संकेत देने में सक्षम एजेंटों के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।

आमतौर पर, एक एंजाइम (पेरोक्सीडेज या फॉस्फेट) का उपयोग ऐसे एजेंट के रूप में किया जाता है, जिसके प्रतिक्रिया उत्पाद का रंग होता है और झिल्ली पर अघुलनशील अवक्षेप के रूप में अवक्षेपित होता है।

इस पद्धति में फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करना भी संभव है।

चावल। 1. अध्ययन किए गए प्रोटीन के इम्यूनोकेमिकल धुंधला होने की योजना: ए - एक एंजाइम लेबल के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना; बी - प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे एक एंजाइम लेबल के साथ संयुग्मित होता है।

शिष्टाचार:

I. जेल और झिल्ली की तैयारी और प्रोटीन इलेक्ट्रोट्रांसफर

वैद्युतकणसंचलन के बाद पॉलीएक्रिलामाइड जेल को ब्लोटिंग बफर (25 मिमी ट्रिस, पीएच 8.3, 192 मिमी ग्लाइसिन, 10% इथेनॉल) के साथ स्नान में रखा गया था।

फिल्टर पेपर की दो शीट, ब्लोटिंग कैसेट के आकार में काटी जाती हैं और ब्लॉटिंग बफर से सिक्त होती हैं, कैसेट के उस हिस्से पर रखी जाती हैं जो एनोड का सामना करेगा। फिर, एक ही बफर के साथ पूर्व-सिक्त एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को फिल्टर पेपर पर रखा जाता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि झिल्ली और कागज के बीच कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।

उसके बाद, जेल को सावधानी से झिल्ली पर रखा जाना चाहिए, फिर से जेल और झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति पर विशेष ध्यान देना चाहिए। सैंडविच गीले फिल्टर पेपर की दो परतों से पूरा होता है, जिसे जेल की सतह पर रखा जाता है (चित्र 2)। परिणामी सैंडविच को कैसेट में जकड़ा जाता है और इलेक्ट्रोड के बीच रखा जाता है ताकि झिल्ली एनोड का सामना करे।

चावल। 2. झिल्ली को प्रोटीन के इलेक्ट्रोट्रांसफर की योजना।

द्वितीय। इलेक्ट्रोट्रांसफर

एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में प्रोटीन का इलेक्ट्रोट्रांसफर 100 वी के निरंतर वोल्टेज पर 30-50 मिनट के लिए 25 एमएम ट्रिस, पीएच 8.3, 192 एमएम ग्लाइसिन, 10% इथेनॉल युक्त बफर में किया जाता है।

इलेक्ट्रोट्रांसफर का समय स्थानांतरित प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है, प्रोटीन जितना बड़ा होता है, इलेक्ट्रोट्रांसफर में उतना ही अधिक समय लगता है। 1% एसिटिक एसिड में 0.3% पोंसेउ एस के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को धुंधला करके इलेक्ट्रोट्रांसपोर्ट की गुणवत्ता और प्रोटीन बैंड की व्यवस्था का आकलन किया गया था। Immunostaining से पहले, झिल्ली प्रोटीन बाध्य डाई को दूर करने के लिए एक हल्के क्षारीय जलीय Tris समाधान के साथ कई बार धोया जाना चाहिए।

तृतीय। एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर प्रोटीन का इम्यूनोकेमिकल धुंधला हो जाना

गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करने के लिए, झिल्ली को पीबीएसटी में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लगातार सरगर्मी के साथ ऊष्मायन किया जाता है (बेहतर अवरुद्ध करने के लिए, 10% स्किम्ड दूध पाउडर युक्त पीबीएसटी समाधान का उपयोग किया जा सकता है)।

अवरुद्ध करने के बाद, झिल्ली को कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए पीबीएसटी में लगातार सरगर्मी के साथ 1-10 माइक्रोग्राम / एमएल विशिष्ट एंटीबॉडी से युक्त किया जाता है।

एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता अनुभवजन्य रूप से चुनी जाती है और एंटीजन के साथ एंटीबॉडी की बातचीत की आत्मीयता पर निर्भर करती है।

ऊष्मायन के अंत में, झिल्ली को PBST के साथ 5 बार धोया गया और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान में स्थानांतरित किया गया। संयुग्म के कमजोर पड़ने को आमतौर पर निर्माता द्वारा पैकेजिंग पर इंगित किया जाता है, या शोधकर्ता द्वारा अनुभवजन्य रूप से चुना जाता है। लगातार सरगर्मी के साथ 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान में झिल्ली को सेते हैं।

पूरी तरह से धोने (कम से कम 5-6 बफर परिवर्तन) के बाद, पीबीएसटी झिल्ली को 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.6 के 10 मिलीलीटर में 3 मिलीग्राम डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10 μl युक्त क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट समाधान में स्थानांतरित किया जाता है। .

ऊष्मायन 5 से 10 मिनट के लिए सरगर्मी के साथ किया जाता है। सब्सट्रेट के साथ ऊष्मायन के अंत के बाद, झिल्ली को पीबीएसटी से धोया जाना चाहिए, फिल्टर पेपर के साथ ब्लोटिंग द्वारा सुखाया जाना चाहिए, और तुरंत रंग में स्कैन करके एक इलेक्ट्रॉनिक प्रतिलिपि बनाई जानी चाहिए। यदि झिल्ली पूरी तरह से सूख जाती है, तो रंगी हुई प्रोटीन धारियां फीकी पड़ जाती हैं, और छवि कम उज्ज्वल और विपरीत हो जाती है।

नोट: DAB विषैला और एक संभावित कार्सिनोजेन है। रबर के दस्ताने के साथ ही काम करें!

डब्ल्यूएचओ की सिफारिश के अनुसार, एचआईवी संक्रमण के निदान में एक अतिरिक्त विशेषज्ञ विधि के रूप में इम्युनोब्लॉटिंग (पश्चिमी धब्बा) का उपयोग किया जाता है, जिसे एलिसा के परिणामों की पुष्टि करनी चाहिए। इस पद्धति का उपयोग आमतौर पर एक सकारात्मक एलिसा परिणाम की दोबारा जांच करने के लिए किया जाता है, क्योंकि इसे अधिक संवेदनशील और विशिष्ट माना जाता है, हालांकि यह अधिक जटिल और महंगी होती है।

इम्युनोब्लोटिंग एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा) को एक जेल में वायरस प्रोटीन के प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में उनके स्थानांतरण के साथ जोड़ती है। इम्युनोब्लॉट प्रक्रिया में कई चरण होते हैं (चित्र 27)। सबसे पहले, पूर्व-शुद्ध और इसके घटक घटकों को नष्ट कर दिया जाता है, एचआईवी वैद्युतकणसंचलन के अधीन होता है, जबकि वायरस बनाने वाले सभी एंटीजन आणविक भार से अलग होते हैं। फिर, ब्लोटिंग द्वारा, एंटीजन को जेल से नाइट्रोसेल्युलोज या नायलॉन फिल्टर की एक पट्टी में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें अब प्रोटीन का एक स्पेक्ट्रम होता है जो एचआईवी की विशेषता है, जो आंखों के लिए अदृश्य है। अगला, परीक्षण सामग्री (रोगी का सीरम, प्लाज्मा, आदि) पट्टी पर लागू होती है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी हैं, तो वे एंटीजन प्रोटीन के स्ट्रिप्स से बंधते हैं जो उनके साथ सख्ती से मेल खाते हैं। बाद के जोड़तोड़ (एलिसा की तरह) के परिणामस्वरूप, इस बातचीत के परिणाम की कल्पना की जाती है - दृश्यमान बनाया जाता है। पट्टी के कुछ क्षेत्रों में धारियों की उपस्थिति सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी के अध्ययन किए गए सीरम में उपस्थिति की पुष्टि करती है।

एचआईवी संक्रमण के निदान की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोब्लोटिंग का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन सेरा को सकारात्मक मानता है यदि इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा एचआईवी लिफाफा प्रोटीनों में से किन्हीं दो के एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है। इन अनुशंसाओं के अनुसार, यदि लिफाफा प्रोटीनों में से केवल एक के साथ प्रतिक्रिया होती है (

रूस में, वर्तमान में, एचआईवी संक्रमण के प्रयोगशाला निदान के लिए मानक प्रक्रिया है एचआईवी के लिए एंटीबॉडी का पता लगानाएंजाइम इम्यूनोएसे का उपयोग करनाप्रतिक्रिया में उनकी विशिष्टता की पुष्टि के बाद प्रतिरक्षा धब्बा।

एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी 90-95% लोगों में संक्रमण के बाद 3 महीने के भीतर, 5-9% में - संक्रमण के क्षण से 6 महीने बाद और 0.5-1% में - बाद की तारीख में दिखाई देते हैं। एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए शुरुआती समय संक्रमण के क्षण से 2 सप्ताह है।

एचआईवी के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने में 2 चरण शामिल हैं। पहले चरण मेंएचआईवी एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के कुल स्पेक्ट्रम का पता लगाने के लिए विभिन्न परीक्षणों का उपयोग किया जाता है: एंजाइम इम्यूनोसे, एग्लूटिनेशन, संयुक्त, कंघी, झिल्ली-फिल्टर या झिल्ली-फैलाना। दूसरे चरण मेंइम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग वायरस के अलग-अलग प्रोटीनों के लिए एंटीबॉडी निर्धारित करने के लिए किया जाता है। कार्य में, केवल उन परीक्षण प्रणालियों का उपयोग करने की अनुमति है जिनके पास रूसी संघ के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा उपयोग की अनुमति है। निदान प्रक्रियाओं को केवल उपयुक्त परीक्षणों के उपयोग के लिए अनुमोदित निर्देशों के अनुसार ही किया जाना चाहिए।

रक्त नमूनाकरण क्यूबिटल नस से 3-5 मिली की मात्रा में एक साफ, सूखी टेस्ट ट्यूब में बनाया जाता है। नवजात शिशुओं से कॉर्ड ब्लड लिया जा सकता है। प्राप्त सामग्री (संपूर्ण रक्त) को कमरे के तापमान पर 12 घंटे से अधिक और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में 1 दिन से अधिक के लिए संग्रहीत करने की अनुशंसा नहीं की जाती है। आगामी हेमोलिसिस विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। सीरम को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा या पाश्चर पिपेट या कांच की छड़ से परखनली की दीवार के साथ रक्त का पता लगाकर अलग किया जाता है। अलग किए गए सीरम को एक साफ (बेहतर रोगाणुहीन) टेस्ट ट्यूब, शीशी या प्लास्टिक कंटेनर में स्थानांतरित किया जाता है, और इस रूप में इसे 4-8 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 7 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। काम करते समय, आपको 5 जुलाई, 1990 के "एड्स नैदानिक ​​​​प्रयोगशालाओं में महामारी-विरोधी शासन पर निर्देश" नंबर 42-28 / 38-90 में दिए गए सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए।

एचआईवी के लिए कुल एंटीबॉडी का निर्धारण।

पहला सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, विश्लेषण 2 बार और किया जाता है (उसी सीरम के साथ और उसी परीक्षण प्रणाली में)। यदि कम से कम एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त हुआ (तीन एलिसा परीक्षणों में से दो सकारात्मक परिणाम), सीरम को संदर्भ प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

संदर्भ प्रयोगशाला में, प्राथमिक सकारात्मक सीरा (अर्थात, जिन्होंने पहले परीक्षण प्रणाली में दो सकारात्मक परिणाम दिए) की पुष्टि के लिए चयनित दूसरे (अन्य) परीक्षण प्रणाली में एलिसा में फिर से जांच की जाती है।

दूसरी परीक्षण प्रणाली में विश्लेषण का सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, आईएस में सीरम की जांच की जानी चाहिए।

यदि दूसरे परीक्षण प्रणाली में एक नकारात्मक परिणाम प्राप्त होता है, तो तीसरे परीक्षण प्रणाली में सीरम की फिर से जांच की जाती है।

यदि दूसरे और तीसरे दोनों परीक्षण प्रणालियों में एक नकारात्मक परीक्षा परिणाम प्राप्त होता है, तो एचआईवी के लिए एंटीबॉडी की अनुपस्थिति पर एक निष्कर्ष जारी किया जाता है।

जब तीसरे परीक्षण प्रणाली में एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त होता है, तो सीरम को प्रतिरक्षा सोख्ता में विश्लेषण के लिए भी भेजा जाता है।

प्रतिरक्षा धब्बा।

विधि का सिद्धांत एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर वायरस के कुछ प्रोटीनों के एंटीबॉडी का पता लगाना है। HIV-1 के लिफाफा प्रोटीन (env) को आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन ("जीपी" या "जीपी") के रूप में संदर्भित किया जाता है, जिसमें आणविक भार किलोडाल्टोन (सीडी) में व्यक्त किया जाता है: 160 केडी, 120 केडी, 41 केडी। HIV-2 में ग्लाइकोप्रोटीन का वजन 140 kd, 105 kd, 36 kd होता है। कोर प्रोटीन (गैग) (आमतौर पर प्रोटीन के रूप में संदर्भित - "पी" या "आर") एचआईवी -1 में क्रमशः 55 केडी, 24 केडी, 17 केडी का आणविक भार होता है, और एचआईवी -2 -56 केडी, 26 केडी , 18 के.डी. एंजाइम HIV-1 (पोल) का आणविक भार 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd है।

इम्यूनोब्लोटिंग परिणामों की व्याख्या सकारात्मक, अनिश्चित और नकारात्मक के रूप में की जाती है।

सकारात्मक(सकारात्मक) नमूने माने जाते हैं जिनमें 2 या 3 एचआईवी ग्लाइकोप्रोटीन के एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है।

नकारात्मक(नकारात्मक) सीरा हैं जो एचआईवी के किसी भी एंटीजन (प्रोटीन) के एंटीबॉडी का पता नहीं लगाते हैं।

नमूने जो एक एचआईवी ग्लाइकोप्रोटीन और/या किसी भी एचआईवी प्रोटीन के एंटीबॉडी का पता लगाते हैं, पर विचार किया जाता है संदिग्ध(अपरिभाषित या व्याख्या करने योग्य)।

जब एचआईवी-1 एंटीजन के साथ प्रतिरक्षा धब्बा में कोर प्रोटीन (गैग) के एंटीबॉडी के साथ एक अनिश्चित परिणाम प्राप्त होता है, तो एचआईवी-2 एंटीजन के साथ एक परीक्षण किया जाता है।

प्रतिरक्षा सोख्ता के सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, परीक्षण सामग्री में एचआईवी के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति के बारे में एक निष्कर्ष निकाला जाता है।

एक नकारात्मक परीक्षा परिणाम प्राप्त होने पर, आईबी एक निष्कर्ष जारी करती है कि एचआईवी के लिए कोई एंटीबॉडी नहीं हैं।

एक अनिश्चित परिणाम प्राप्त होने पर (यदि p24 एंटीजन का पता नहीं चला था), 3 महीने के बाद एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी के लिए बार-बार परीक्षण किए जाते हैं,

और 3 महीने के बाद अनिश्चित परिणाम बनाए रखते हुए। यदि p24 एंटीजन का पता चला है, तो पहला अनिश्चित परिणाम प्राप्त करने के 2 सप्ताह बाद दूसरी परीक्षा की जाती है।

यदि, पहली जांच के 6 महीने बाद, अनिश्चित परिणाम फिर से प्राप्त होते हैं, और रोगी में एचआईवी संक्रमण के संक्रमण और नैदानिक ​​​​लक्षणों के लिए जोखिम कारक नहीं होते हैं, तो परिणाम को गलत सकारात्मक माना जाता है। (यदि महामारी विज्ञान और नैदानिक ​​​​संकेत हैं, तो निर्धारित अनुसार सीरोलॉजिकल अध्ययन दोहराए जाते हैं)।

पुनः संयोजक वायरस-विशिष्ट पॉलीपेप्टाइड्स "एचआईवी ब्लॉट" का उपयोग करके प्रतिरक्षा सोख्ता इस मायने में भिन्न है कि यह स्वयं वायरल प्रोटीन का उपयोग नहीं करता है, लेकिन पुनः संयोजक पॉलीपेप्टाइड - एचआईवी एंटीजन ("एनवी1", "गैग1", "पोल", "एनवी2") के अनुरूप है। पुनः संयोजक Env1 पॉलीपेप्टाइड सीधे HIV-1 gp120 और gp41, Gag1 पॉलीपेप्टाइड से p17 और p24 एंटीजन, Po11 पॉलीपेप्टाइड से p51 एंटीजन, Env2 पॉलीपेप्टाइड से HIV-2 gp110 और gp38 एंटीजन का पता लगाता है। सीरम को सकारात्मक माना जाता है यदि यह या तो Env1 या Env2 या दोनों Env (एचआईवी प्रकार 1 और 2 दोहरे संक्रमण) के साथ प्रतिक्रिया करता है। केवल पोल और गैग के साथ एक प्रतिक्रिया को एक अनिश्चित परिणाम के रूप में माना जाता है, इस मामले में एचआईवी लाइसेट का उपयोग करके एक क्लासिक इम्युनोब्लॉट के अनिश्चित परिणामों के मामलों के समान ही अनुवर्ती कार्रवाई की जाती है।

एचआईवी संक्रमित माताओं से पैदा हुए बच्चों में एचआईवी संक्रमण के सीरोलॉजिकल निदान की ख़ासियत यह है कि जीवन के पहले 6-12 महीनों में संक्रमित और असंक्रमित दोनों बच्चों में मातृ मूल के एचआईवी के एंटीबॉडी होते हैं, जो तब गायब हो सकते हैं। एक बच्चे में एचआईवी संक्रमण की उपस्थिति का संकेत देने वाला मानदंड 18 महीने या उससे अधिक की उम्र में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना है। एचआईवी संक्रमित मां से पैदा हुए 18 महीने के बच्चे में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी का अभाव एचआईवी संक्रमण के खिलाफ एक मानदंड है।

इम्यूनोब्लॉट(वेस्टर्न ब्लाट) - एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए रक्त सीरम के प्रयोगशाला परीक्षण की एक विधि; यह एलिसा की तुलना में अधिक सटीक परीक्षण है और इसका उपयोग एलिसा परिणामों की पुष्टि के लिए किया जाता है। एलिसा - एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा) - प्रयोगशाला अनुसंधान, जो रक्त में एचआईवी एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है; एचआईवी एंटीबॉडी परीक्षण।

डब्ल्यूएचओ की सिफारिश के अनुसार, एचआईवी संक्रमण के निदान में एक अतिरिक्त विशेषज्ञ विधि के रूप में इम्युनोब्लॉटिंग (पश्चिमी धब्बा) का उपयोग किया जाता है, जिसे एलिसा के परिणामों की पुष्टि करनी चाहिए। इस पद्धति का उपयोग आमतौर पर एक सकारात्मक एलिसा परिणाम की दोबारा जांच करने के लिए किया जाता है, क्योंकि इसे अधिक संवेदनशील और विशिष्ट माना जाता है, हालांकि यह अधिक जटिल और महंगी होती है।

इम्युनोब्लोटिंग एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा) को एक जेल में वायरस प्रोटीन के प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में उनके स्थानांतरण के साथ जोड़ती है। इम्युनोब्लॉट प्रक्रिया में कई चरण होते हैं ()। सबसे पहले, पूर्व-शुद्ध और इसके घटक घटकों को नष्ट कर दिया जाता है, एचआईवी वैद्युतकणसंचलन के अधीन होता है, जबकि वायरस बनाने वाले सभी एंटीजन आणविक भार से अलग होते हैं। फिर, ब्लोटिंग द्वारा, एंटीजन को जेल से नाइट्रोसेल्युलोज या नायलॉन फिल्टर की एक पट्टी में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें अब प्रोटीन का एक स्पेक्ट्रम होता है जो एचआईवी की विशेषता है, जो आंखों के लिए अदृश्य है। अगला, परीक्षण सामग्री (रोगी का सीरम, प्लाज्मा, आदि) पट्टी पर लागू होती है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी हैं, तो वे एंटीजन प्रोटीन के स्ट्रिप्स से बंधते हैं जो उनके साथ सख्ती से मेल खाते हैं। बाद के जोड़तोड़ (एलिसा की तरह) के परिणामस्वरूप, इस बातचीत के परिणाम की कल्पना की जाती है - दृश्यमान बनाया जाता है। पट्टी के कुछ क्षेत्रों में धारियों की उपस्थिति सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी के अध्ययन किए गए सीरम में उपस्थिति की पुष्टि करती है।

एचआईवी संक्रमण के निदान की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोब्लोटिंग का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन सेरा को सकारात्मक मानता है यदि इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा एचआईवी लिफाफा प्रोटीनों में से किन्हीं दो के एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है। इन सिफारिशों के अनुसार, यदि अन्य प्रोटीनों के साथ या बिना प्रतिक्रिया के संयोजन में केवल एक आवरण प्रोटीन (gp160, gp120, gp41) के साथ प्रतिक्रिया होती है, तो परिणाम को संदिग्ध माना जाता है और एक किट का उपयोग करके एक दूसरे अध्ययन की सिफारिश की जाती है। अलग श्रृंखला या किसी अन्य कंपनी से। यदि उसके बाद भी परिणाम संदिग्ध रहता है, तो अध्ययन हर 3 महीने में जारी रहता है।

इम्युनोब्लॉटिंग के लिए, पहले चरण में, रक्त सीरम में निहित प्रोटीन को एक जेल में उनके आणविक भार के अनुसार अलग किया जाता है और एक विद्युत क्षेत्र (जेल वैद्युतकणसंचलन विधि) का उपयोग करके चार्ज किया जाता है। फिर एक नाइट्रोसेल्युलोज या नायलॉन झिल्ली को जेल पर लगाया जाता है और "गीला" किया जाता है (यह सोखना है)। यह एक विशेष कक्ष में किया जाता है, जो जेल से झिल्ली तक सामग्री के पूर्ण हस्तांतरण की अनुमति देता है। नतीजतन, प्रोटीन व्यवस्था का पैटर्न जो जेल पर था, झिल्ली (ब्लॉट) पर पुन: उत्पन्न होता है, जिसे बाद में आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। प्रारंभ में, झिल्ली को वांछित प्रतिजन के एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है, और अनबाउंड सामग्री को धोने के बाद, एक रेडियोधर्मी लेबल वाला संयुग्म जोड़ा जाता है जो विशेष रूप से एंटीबॉडी (एलिसा में) को बांधता है। परिणामी एंटीजन-एंटीबॉडी-लेबल संयुग्म परिसर का स्थान एक्स-रे फिल्म का उपयोग करके ऑटोरैडियोग्राफी द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके प्रकट होने के बाद सब कुछ स्पष्ट हो जाता है कि रक्त में एंटीजन हैं या नहीं।