Odkrivanje protiteles proti virusu. Imunski bloting I. Priprava gela in membrane ter elektrotransfer beljakovin

IMUNOBLOT(western blot) - metoda laboratorijske raziskave krvni serum za prisotnost protiteles proti HIV; je natančnejši test kot ELISA in se uporablja za potrditev rezultatov ELISA. ELISA - encimski imunski test (ELISA) - laboratorijski test, ki vam omogoča določanje prisotnosti protiteles proti HIV v krvi; Test protiteles proti HIV.

Po priporočilu SZO se pri diagnostiki okužbe s HIV uporablja imunobloting (western blot) kot dodatna strokovna metoda, ki naj potrdi rezultate testa ELISA. Ta metoda se običajno uporablja za preverjanje pozitiven rezultat z ELISA, saj velja za bolj občutljivo in specifično, čeprav bolj zapleteno in dražje.

Imunobloting združuje encimski imunski test (ELISA) s predhodno elektroforetično ločitvijo virusnih proteinov v gelu in njihovim prenosom na nitrocelulozno membrano. Postopek imunoblota je sestavljen iz več faz (). HIV, predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, ki sestavljajo virus, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem antigeni prenesejo iz gela na trak iz nitroceluloze ali najlonski filter, ki zdaj vsebuje očesu neviden spekter proteinov, ki je značilen za HIV. Nato se na trak nanese testni material (serum, plazma bolnika itd.) in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na trakove antigenskih proteinov, ki jim strogo ustrezajo. Kot rezultat kasnejših manipulacij (kot je ELISA) je rezultat te interakcije vizualiziran – viden. Prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Imunobloting se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. WHO meni, da so serumi pozitivni, če se z imunoblotingom odkrijejo protitelesa proti katerim koli dvema proteinoma ovojnice HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od proteinov ovojnice (gp160, gp120, gp41) v kombinaciji z ali brez reakcije z drugimi proteini, se rezultat šteje za dvomljiv in se priporoča druga študija z uporabo kompleta iz druge serije ali drugega podjetja. Če po tem rezultat ostane dvomljiv, se študije nadaljujejo vsake 3 mesece.

Pri imunoblotingu se na prvi stopnji beljakovine v krvnem serumu ločijo v gelu glede na njihovo molekulsko maso in naboj z električnim poljem (metoda gelske elektroforeze). Nato se na gel nanese nitrocelulozna ali najlonska membrana in jo "namoči" (to je blotting). To poteka v posebni komori, ki omogoča popoln prenos materiala iz gela na membrano. Posledično se vzorec razporeditve beljakovin, ki je bil na gelu, reproducira na membrani (blot), ki jo je nato mogoče enostavno manipulirati. Sprva membrano obdelamo s protitelesi proti želenemu antigenu, po izpiranju nevezanega materiala pa dodamo radioaktivno označen konjugat, ki se specifično veže na protitelesa (kot pri ELISA). Lokacijo nastalega konjugiranega kompleksa antigen-protitelo določimo z avtoradiografijo z uporabo rentgenskega filma. Po njegovi manifestaciji postane vse jasno, ali so v krvi antigeni ali ne.

Njegovo ime je AIDS Vyacheslav Zalmanovich Tarantul

Imunobloting - dodatna posredna metoda

Poleg ELISA se v nekaterih primerih za testiranje na okužbo s HIV uporablja postopek, imenovan »imunoblotting« ali »imune blotting« (včasih imenovan tudi »western blotting«). Po priporočilu WHO se imunobloting uporablja pri diagnostiki okužbe s HIV kot dodatna strokovna metoda, ki naj potrdi rezultate ELISA. Ta metoda se običajno uporablja za dvojno preverjanje pozitivnega rezultata ELISA, saj velja za bolj občutljivo in specifično, čeprav je bolj zapletena in dražja. Toda preden podpiše končno sodbo o bolniku, mora biti zdravnik popolnoma prepričan o pravilnosti diagnoze. Zato vprašanje zahtevnosti in visokih stroškov tukaj ne more biti odločilno.

Tako po namenu kot po metodi izvajanja je dobro znani izraz "napihati" zelo primeren za imunski bloting. Imunobloting združuje encimski imunski test (ELISA) s predhodno elektroforetično ločitvijo virusnih proteinov v gelu in njihovim prenosom na nitrocelulozno membrano (»blotter«). Imunoblot postopek je sestavljen iz več stopenj (slika 27). HIV, predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, ki sestavljajo virus, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem (podobno kot iztiskanje odvečnega črnila na "blotter") antigeni prenesejo iz gela na trak iz nitroceluloze ali najlonski filter, ki zdaj vsebuje vrsto beljakovin, značilnih za HIV, ki so očem nevidne. . Nato se na trak nanese testni material (serum, pacientova krvna plazma itd.) in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na trakce antigenskih proteinov, ki jim strogo ustrezajo. Kot rezultat kasnejših manipulacij (kot je ELISA) je rezultat te interakcije vizualiziran – viden. Navsezadnje prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v proučevanem serumu.

Imunobloting se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. WHO meni, da so serumi pozitivni, če se z imunoblotingom odkrijejo protitelesa proti katerim koli dvema proteinoma ovojnice HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od ovojnih proteinov (gp160, gp120, gp41), v kombinaciji ali brez reakcije z drugimi proteini, se rezultat obravnava kot dvomljiv in se opravi drugi test z uporabo kompleta iz druge serije oz. od drugega podjetja je priporočljivo. Za zavarovanje, če

riž. 27. Za imunobloting se na prvi stopnji beljakovine v krvnem serumu ločijo v gelu glede na njihovo molekulsko maso in naboj z električnim poljem (metoda gelske elektroforeze). Nato se na gel nanese nitrocelulozna ali najlonska membrana in jo "mokro" (to je blotting). To poteka v posebni komori, ki omogoča popoln prenos materiala iz gela na membrano. Posledično se vzorec razporeditve beljakovin, ki je bil na gelu, reproducira na membrani (blot), ki jo je nato mogoče enostavno manipulirati. Sprva membrano obdelamo s protitelesi proti želenemu antigenu, po izpiranju nevezanega materiala pa dodamo radioaktivno označen konjugat, ki se specifično veže na protitelesa (kot pri ELISA). Lokacijo nastalega konjugiranega kompleksa antigen-protitelo določimo z avtoradiografijo z uporabo rentgenskega filma. Po njeni manifestaciji postane jasno, ali so v krvi antigeni ali ne, in potem rezultat ostane dvomljiv, priporočljivo je spremljanje šest mesecev (raziskava se nadaljuje vsake tri mesece).

Trenutno je v Ruski federaciji priporočljivo uporabljati pet testnih sistemov za uporabo pri diagnosticiranju okužbe s HIV, med katerimi so ruski in tuji.

Iz knjige Anesteziologija in reanimatologija avtor Marina Aleksandrovna Kolesnikova

Iz knjige Nenavadnosti našega telesa. Zabavna anatomija avtorja Steven Juan

Iz knjige Priročnik prve pomoči avtor Nikolaj Berg

Iz knjige Kako 100% prenehati kaditi ali Imejte se radi in spremenite svoje življenje avtor David Kipnis

Iz knjige The Complete Guide to Nursing avtor Elena Jurijevna Khramova

Iz knjige Priročnik nujno oskrbo avtor Elena Jurijevna Khramova

Iz knjige CARSKI REZ: Varen izhod ali grožnja prihodnosti? avtorja Michelle Auden

avtorja Gary Griffin

Iz knjige Kako povečati velikost moškega penisa avtorja Gary Griffin

Iz knjige Plosko stopalo. večina učinkovite metode zdravljenje avtor Aleksandra Vasiljeva

Iz knjige Lepota in zdravje ženske avtor Vladislav Gennadijevič Lifljandski

Iz knjige Joga in spolne prakse avtorja Nick Douglas

Kaj je to - imunoblot? To je običajna laboratorijska diagnostična metoda. virusne okužbe oseba. Velja za enega najbolj natančnih in zanesljivih načinov odkrivanja prisotnosti HIV. V svoji zanesljivosti presega celo rezultate imunoblota, ki veljajo za neizpodbitne in dokončne.

splošne informacije

Imunoblot - kaj je to? Da bi prepoznali okužbo s HIV pri osebi, je treba opraviti laboratorijski test krvnega seruma za prisotnost protiteles. Tehnika Western blot se imenuje tudi Western blot. Uporablja se za odkrivanje človeških virusnih okužb kot dodatna ekspertna metoda. Potrebno je potrditi ELISA - laboratorijski test, ki vam omogoča ugotavljanje prisotnosti protiteles proti HIV v krvi. Ponovno preverjanje z imunoblotingom pozitivna analiza ELISA. Velja za najbolj občutljivo, zapleteno in drago.

namen

Kaj je to - imunoblot? To je tehnika laboratorijskega testiranja krvnega seruma na prisotnost protiteles proti virusu. Med študijo specialist predhodno loči beljakovine virusa v gelu in jih prenese na nitrocelulozno membrano. Postopek imunoblotinga je namenjen določanju HIV za različnih stopnjah. Na prvi stopnji se očiščen virus iz njegovih sestavnih delov podvrže elektroforezi, antigeni, ki sestavljajo njegovo sestavo, pa se ločijo po molekulski masi.

Razmnožuje se v živi celici in vanjo vgradi svoje genetske informacije. Na tej stopnji oseba postane nosilec virusa HIV, če je bila okužena. Posebnost bolezni je, da za dolgo časa se morda sploh ne prikaže. Virus uniči limfocite, zato se zmanjša človeška imunost in telo se ne more upreti okužbam. Če se HIV zdravi kompetentno in pravočasno, bo bolnik živel do visoke starosti. Pomanjkanje terapije neizogibno vodi v smrt. Od trenutka okužbe, vendar brez zdravljenja, največja življenjska doba ni več kot deset let.

Posebnosti

Imunoblot analiza je zanesljiva metoda, ki vam omogoča ugotavljanje prisotnosti protiteles proti antigenom HIV prve in druge vrste. Če je oseba okužena, se v dveh tednih pojavijo protitelesa, ki jih lahko odkrijemo veliko kasneje. Posebnost HIV je, da se število protiteles hitro poveča in ostane v krvi bolnika. Tudi če so prisotni, se bolezen morda ne manifestira dve ali več let. Metoda ELISA ne določa vedno natančno prisotnosti bolezni, zato je potrebna potrditev rezultatov z imunoblotingom in PCR, če je encimski imunski test pozitiven.

Indikacije za imenovanje

Kaj je ta "imunoblot", je že ugotovljeno, toda kdo je predpisan ta študija? Razlog za opravljanje testov za metodo imunoblotinga je pozitiven rezultat ELISA. Za bolnike, ki bodo operirani, je treba opraviti encimski imunski test. Poleg tega je treba opraviti analizo za ženske, ki načrtujejo nosečnost, pa tudi za vse, ki so spolno promiskuitetne. Bolnikom z virusom HIV dodelite imunobloting, če so rezultati ELISA dvomljivi. Naslednji zaskrbljujoči simptomi so lahko razlog za obisk zdravnika:

ostra izguba teže;
šibkost, izguba delovne sposobnosti;
črevesna motnja (driska), ki traja tri tedne;
dehidracija telesa;
vročina;
porast bezgavke na telesu;
razvoj kandidiaze, tuberkuloze, pljučnice, toksoplazmoze, poslabšanja herpesa.

Pacientu se pred darovanjem ni treba pripravljati venske krvi. 8-10 ur pred študijo ne morete jesti. Dan pred krvodajalstvom ni priporočljivo piti alkoholnih in kavnih pijač, se ukvarjati s težkimi fizičnimi vajami, doživljati vznemirjenja.

Kje opraviti analizo?

Kje se lahko testiram na HIV? ELISA, imunoblot študije se izvajajo v mestnih zasebnih klinikah, rezultati so izdani v enem dnevu. Možna je tudi takojšnja diagnoza. V državnih zdravstvenih ustanovah se testi ELISA in imunobloting izvajajo brezplačno v skladu z zakonodajo Ruske federacije. Obvezno preverjanje za nalezljive bolezni nosečnice, pa tudi bolniki, ki bodo hospitalizirani ali operirani.

Kako poteka raziskava?

Kako se izvaja ELISA? Imunoblot pozitiven/negativen potrdi ali ovrže rezultate encimskega imunskega testa. Postopek raziskovanja je precej preprost. Specialist opravi vzorčenje venske krvi, čas ne traja več kot pet minut. Po vzorčenju je treba mesto vboda razkužiti in zalepiti z obližem. Vzorčenje poteka na prazen želodec, tako da po posegu ne boli pojesti tablico temne čokolade ali popiti sladko vročo pijačo.

Če želite dobiti napotnico za brezplačno analizo v javni zdravstveni ustanovi, morate obiskati splošnega zdravnika. Na splošno se imunoblot po načinu vzorčenja ne razlikuje od drugih krvnih preiskav. Metodologija raziskave je preprosta. Če je virus prisoten v človekovi krvi, telo začne proizvajati protitelesa, da ga uniči. Vsak virus ima svoj niz antigenskih proteinov. Odkrivanje teh protiteles je osnova Western blotting tehnike.

Cena

Koliko stane analiza? Imunoblot za HIV ne velja za poceni raziskave. V povprečju presejalni pregled z encimskim imunskim testom stane od 500 do 900 rubljev. Imunoblotting je verifikacijska študija, katere stroški so od tri do pet tisoč rubljev. Bolj zapletene metode so veliko dražje. Na primer, za to boste morali plačati približno 12.000 rubljev.

Razlaga rezultata

Najpogostejši metodi za diagnosticiranje okužbe s HIV sta encimski imunski test in imunoblot. Uporabljajo se za določanje serumskih protiteles proti virusu imunske pomanjkljivosti. Prisotnost okužbe običajno potrdimo z dvema testoma: presejalnim in potrditvenim. Interpretacijo rezultatov študije mora opraviti zdravnik, on tudi postavi diagnozo in predpiše zdravljenje. Če je imunoblot pozitiven, to pomeni, da je v človeškem telesu prisoten virus.

Pozitiven rezultat ne sme biti razlog za samozdravljenje, saj ima lahko vsak bolnik svojo sliko bolezni. Kvalitativna analiza vključuje presejanje in preverjanje. Če bolnik nima virusa, je rezultat označen kot "negativen". Ko se odkrije s presejalno metodo, se izvede dodatna verifikacijska študija. Imunoblot je analiza, ki potrdi ali ovrže presejanje. Če se na testnem traku pojavi zatemnitev na določenih območjih (mesta lokalizacije beljakovin), se postavi diagnoza HIV. Če so rezultati dvomljivi, se testi opravijo v treh mesecih.

Okužbo z virusom imunske pomanjkljivosti lahko preprečite, če upoštevate določena pravila: izogibajte se priložnostnim spolnim odnosom, med stiki uporabljajte kondom, ne jemljite drog. Če se bolezen odkrije pri nosečnici, je pomembno, da dosledno upoštevate priporočila lečečega zdravnika, ne pozabite opraviti pregledov za prisotnost virusa.

Imunski blot (imunoblot, Western blot, Western blot)- združuje encimski imunosorbentni test (ELISA) s predhodnim elektroforetskim prenosom virusnih antigenov na nitrocelulozni trak (trak).

V tem lepem znanstvenem imenu se "blot" najverjetneje prevede kot "blot", "western" kot "western" pa odraža smer porazdelitve te "blot" na papirju od leve proti desni, to je na geografskem zemljevidu, to ustreza smeri od zahoda proti vzhodu. ". Bistvo metode "imunskega blota" je, da se imunoencimska reakcija ne izvaja z mešanico antigenov, temveč z antigeni HIV, ki so predhodno razdeljeni z imunoforezo v frakcije, ki se nahajajo glede na molekulsko maso na površini nitrocelulozne membrane. Posledično so glavni proteini HIV, nosilci antigenskih determinant, razporejeni po površini v obliki ločenih pasov, ki se pojavijo med encimskim imunskim testom.

Imunoblot vključuje več stopenj:

Priprava traku. Virus imunske pomanjkljivosti (HIV), ki je predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, podvržemo elektroforezi, medtem ko antigene, ki sestavljajo HIV, ločimo po molekulski masi. Nato se z blotiranjem (analogno iztiskanju odvečnega črnila na "blotterju") antigeni prenesejo na trak iz nitroceluloze, ki zdaj vsebuje spekter antigenskih trakov, značilnih za HIV, očem nevidnih.

Vzorčna študija. Testni material (serum, krvna plazma bolnika itd.) se nanese na nitrocelulozni trak, in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na strogo ustrezne (komplementarne) antigenske trakove. Kot rezultat kasnejših manipulacij se rezultat te interakcije vizualizira – postane viden.

Razlaga rezultata. Prisotnost pasov na določenih območjih nitrocelulozne plošče potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Proga A - Pozitivna kontrola

Proga B - Šibka pozitivna kontrola

Proga C - negativna kontrola

Trak D - pozitiven vzorec (odkrita protitelesa proti HIV-1)

Trenutno je imunski blot (imunoblot) glavna metoda za potrditev prisotnosti virusno specifičnih protiteles v testnem serumu. V nekaterih primerih okužbe s HIV se pred serokonverzijo specifična protitelesa učinkoviteje odkrijejo z imunoblotingom kot z ELISA. Študija imunskega blotinga je pokazala, da so protitelesa proti gp 41 najpogosteje odkrita v serumih bolnikov z aidsom, odkrivanje p24 pri osebah, pregledanih v profilaktične namene, pa zahteva dodatne študije na prisotnost okužbe s HIV. Imunoblot testni sistemi, ki temeljijo na gensko spremenjenih rekombinantnih proteinih, so se izkazali za bolj specifične od običajnih sistemov, ki temeljijo na prečiščenem virusnem lizatu. Pri uporabi rekombinantnega antigena se ne oblikuje razpršen, ampak jasno definiran ozek pas antigena, ki je lahko dostopen za obračunavanje in vrednotenje.

Serum oseb, okuženih s HIV-1, odkrije protitelesa proti naslednjim glavnim proteinom in glikoproteinom - proteini strukturne ovojnice (env) - gp160, gp120, gp41; jedra (gag) - p17, p24, p55, kot tudi virusni encimi (pol) - p31, p51, p66. Za HIV-2 so značilna protitelesa proti env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Med laboratorijskimi metodami, ki so potrebne za ugotavljanje specifičnosti reakcije, ima največjo prepoznavnost dokazovanje protiteles proti ovojnim proteinom HIV-1 - gp41, gp120, gp160 in HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO meni, da so serumi pozitivni, če z imunoblotingom odkrijemo protitelesa proti katerim koli glikoproteinom HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od proteinov ovojnice (rp 160, rp 120, rp 41) v kombinaciji ali brez reakcije z drugimi proteini, se rezultat šteje za dvomljiv in se priporoča drugi test z uporabo kompleta iz druge serije ali drugega podjetja. Če po tem rezultat ostane dvomljiv, je priporočljivo opazovanje 6 mesecev (raziskava po 3 mesecih).

Razpoložljivost pozitivna reakcija z antigenom p24 lahko kaže na obdobje serokonverzije, saj se včasih najprej pojavijo protitelesa proti temu proteinu. V tem primeru je glede na klinične in epidemiološke podatke priporočljivo ponoviti študijo z vzorcem seruma, odvzetim vsaj 2 tedna pozneje, in to je ravno v primeru, ko so pri okužbi s HIV potrebni parni serumi.

Pozitivne reakcije z beljakovinami gag in pol brez prisotnosti reakcije z beljakovinami env lahko odražajo stopnjo zgodnje serokonverzije in lahko kažejo tudi na okužbo s HIV-2 ali nespecifično reakcijo. Osebe s takšnimi rezultati po testiranju na HIV-2 se ponovno pregledajo po 3 mesecih (v 6 mesecih).