Imunobloting HIV pozitiven. Kako se AIDS diagnosticira z imunoblotom za HIV Imunoblot - kaj je to? Imunoblot pri diagnostiki nalezljivih bolezni

Značilne lastnosti:

• Komplet reagentov "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" vsebuje prečiščene lizatne virusne proteine ​​HIV 1 in peptid - HIV-2 gp36 antigenski determinant;
• Zagotavlja odkrivanje protiteles proti HIV-1, HIV-1 skupine O, HIV 2 na enem traku;
• Enostaven postopek za pripravo in izvedbo analiz;
• Notranji nadzor kakovosti reakcije*
• Največja hitrost analize (3 ure);
• Majhen volumen preskusnega vzorca - 20 µl;
• Ne potrebuje dodatne opreme za raziskave;
• Kakovost kompleta je zagotovljena z uporabo ruskih in mednarodnih standardnih vzorcev**

* Notranja kontrola kakovosti je zagotovljena s prisotnostjo:

• notranji kontrolni trakovi, zagotavlja kontrolo vnosa vzorca seruma ali plazme;
• kontrolni negativni serum (K-);
• kontrolni pozitivni serum (K+), ki omogoča identifikacijo trakov, zaznanih na traku;
• kontrolni šibko pozitivni serum (K + cl), ki omogoča kontrolo občutljivosti reagentnega kompleta.

**Zagotavljanje kakovosti:

Lastnosti reagentnega kompleta MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 so bile določene s testiranjem vzorcev naključnega vzorca darovalcev, bolnikov z diagnozo okužba z virusom HIV, komercialne plošče za serokonverzijo, standardne plošče in vzorci s "potencialno motečimi" komponentami.

Komplet reagenta ne daje lažno pozitivnih rezultatov pri študiji serumov standardne plošče, ki ne vsebujejo protiteles proti HIV 1.2 in antigenu HIV-1 ("Standard AT (-) HIV", št. FSR 2007/00953 od 10/ 25/2007). Specifičnost - 100%.

Diagnostična specifičnost je bila določena s preučevanjem naključnega vzorca 200 darovalcev iz različnih krvnih centrov in klinik s predhodno potrjeno odsotnostjo okužbe s HIV-1, HIV-2. Specifičnost v raziskavi naključnega vzorca darovalcev je bila 100 %;

Specifičnost kompleta reagentov je bila določena v študiji 250 vzorcev, vključno z vzorci seruma ali plazme, pridobljenimi od nosečnic, hospitaliziranih bolnikov, bolnikov s hepatitisom C in E ter vzorcev s komponentami "potencialno motečega določanja". Pri uporabi kompleta MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 pri teh vzorcih niso našli lažno pozitivnih rezultatov.

Diagnostična občutljivost je bila določena z uporabo:
- Boston Biomedica, Inc. panelni vzorci plazme HIV-1 (WWRB 301) iz različnih regij, ki vsebujejo različne podtipe HIV-1: skupina M (podtipi A, B, C, D, E, F) in skupina O; občutljivost reagentnega kompleta je bila 100 %;

Občutljivost kompleta reagentov je bila določena v študiji mednarodnih panelov za serokonverzijo Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. št. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932, PRB 940

Komplet reagentov zaznava protitelesa proti HIV-1 v serumih standardne plošče, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1 (»Standard AT (+) HIV-1«, št. FSR 2007/00953 z dne 25. oktobra 2007), zazna protitelesa proti HIV-2 v serumih standardne plošče, ki vsebuje protitelesa proti HIV-2 ("Standard AT (+) HIV-2", št. FSR 2007/00953 z dne 25.10.2007). Občutljivost - 100%.

Potrdilo o registraciji št. FSR 2010/07958 z dne 13.07.2011 (veljavnost ni omejena)

spojina:

• Imunosorbent. Bele nitrocelulozne membranske trakove s posameznimi HIV-1 proteini (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17), adsorbiranimi z metodo elektrotransferja in nanesenimi na trak s sintetičnim HIV-2 peptidom, analog proteina gp36 in humani anti-IgG (notranja kontrola) - 18 kosov;
• K- - kontrolni negativni serum. Človeški krvni serum, ki ne vsebuje protiteles proti HIV-1,2, HCV, antigena HIV, HBsAg, se inaktivira s segrevanjem pri 560C; prozorna svetlo rumena tekočina - 1 epruveta (0,08 ml). Vsebuje konzervanse: timerosal in natrijev azid;
• K+ - kontrolni pozitivni serum. Človeški krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1,2 (titer najmanj 1:10000), ne vsebuje HBsAg, antigen HIV, protitelesa proti HCV, inaktivirana s segrevanjem pri 560C; prozorna svetlo rumena tekočina - 1 epruveta (0,08 ml) Vsebuje konzervansa: timerosal in natrijev azid;
• K+sl - kontrolni šibko pozitivni serum. Človeški krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1,2 (titer ne več kot 1:200), ne vsebuje HBsAg, antigen HIV, protitelesa proti HCV, inaktivirana s segrevanjem pri 560C; prozorna svetlo rumena tekočina - 1 epruveta (0,08 ml). Vsebuje konzervanse: timerosal in natrijev azid;
• RROKk (x10) - raztopina za redčenje vzorcev in konjugata. Koncentrat – Tris pufer, ki vsebuje predhodno obdelan normalni kozji serum; neprozorna siva tekočina - 1 viala (10 ml). Vsebuje konzervans: timerosal;
• PRk (x20) - raztopina za pranje. Koncentrat - Tris pufer, ki vsebuje Tween-20; bistra brezbarvna tekočina - 1 viala (70 ml). Vsebuje konzervans: timerosal;
• Konjugat. Kozja protitelesa proti humanemu IgG, konjugirana z alkalno fosfatazo; bistra brezbarvna tekočina - 1 epruveta (0,06 ml);
• Substrat (barvna raztopina). Raztopina 5-bromo-4-fluoro-indolil-fosfata (BCIP) in nitrozin tetrazolija (NBT); prozorna svetlo rumena tekočina - 1 viala (50 ml);
• Puder za imunski bloting. Posneto mleko v prahu - amorfen bel ali svetlo rumen prah - 5 paketov x 1g;
• Tableta s pokrovom za nastavitev reakcije - 2 kosa;
• Plastična pinceta - 1 kos.

Imunobloting -(iz angleškega "blot" - madež) - metoda za identifikacijo antigenov (ali protiteles) z uporabo znanih serumov (ali antigenov). Je kombinacija gelske elektroforeze z ELISA. Sprva bakterijske celice oziroma virione uničimo z ultrazvokom, nato pa z elektroforezo ločimo vse antigene virusa oziroma bakterijske celice in na posebni nitrocelulozni foliji dobimo komercialni reagent. Pri postavitvi imunoblotinga se testni serum bolnika nanese na film z znanimi antigeni. Po inkubaciji in izpiranju nevezanih protiteles nadaljujejo z ELISA - antiserum proti človeškim imunoglobulinom, označenim z encimom in kromogenim substratom, ki ob interakciji z encimom spremeni barvo. V prisotnosti antigen-protitelo-protiseruma proti kompleksom imunoglobulin-encim se na nosilcu pojavijo barvne lise. Metoda imunoblotinga vam omogoča ločeno odkrivanje protiteles proti različnim antigenom patogena (na primer pri okužbi s HIV imunobloting zazna protitelesa proti gp120, gp24 in drugim antigenom virusa).

Radioimunski test (RIA)

Metoda temelji na reakciji antigen-protitelo z uporabo oznake antigena ali protitelesa z radionuklidom. Za oznako se uporabljajo radionuklidi 125I, 14C, 3H, 51Cr in drugi. Nastale imunske komplekse izoliramo iz sistema in jim določimo radioaktivnost na števcih (β-sevanje). Intenzivnost sevanja je premo sorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.

Različica RIA v trdni fazi z uporabo označenih protiteles ali antigenov, adsorbiranih v jamicah polistirenskih plošč, se pogosto uporablja.

RIA se uporablja za odkrivanje antigenov mikrobov, virusov, različnih hormonov, encimov, zdravilne snovi, imunoglobulini, pa tudi druge snovi, ki jih preskusni material vsebuje v manjših koncentracijah 10-12-10-15 g / l.

testna vprašanja

Reakcija imunske bakteriolize: kakšna je reakcija; kaj je antigen, kaj je protitelo, reakcijski mehanizem, metode nastavitve, praktična uporaba. Reakcija imunske hemolize: potrebne sestavine, način nastavitve; kontrole, praktična uporaba. Reakcija lokalne hemolize v gelu (Yernova reakcija): princip reakcije, način priprave, praktična uporaba. Reakcija vezave komplementa: princip reakcije; kaj nastane pri interakciji imunskega seruma s specifičnim antigenom; kaj se zgodi s komplementom, če je prisoten v tej interakciji? Kakšna je usoda komplementa, če med antigenom in protitelesi ni specifične afinitete? S kakšno reakcijo lahko ugotovimo, kaj se je zgodilo s komplementom; zakaj se ta reakcija uporablja; kar je vidno pozitiven rezultat RSK? Zakaj? Katera lastnost komplementa se uporablja v prvi fazi CSC? V drugi fazi? Če je končni rezultat RSK hemoliza, kaj to pomeni - pozitivno oz negativen rezultat? Razloži rezultate: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Poimenuj sestavine prvega sistema RSK in sestavine drugega sistema RSK. Zakaj je treba testni serum inaktivirati? Kako se titrira komplement? Hemolitični serum: kaj vsebuje, kako se pridobi, kaj je titer in kako se določi? Katere živali se uporabljajo za pridobivanje komponent RSC? Tehnika postavljanja RSC na hladno. Pri postavitvi katere od naslednjih reakcij je potrebna udeležba komplementa: precipitacija, flokulacija, aglutinacija, odkrivanje nepopolnih protiteles, imunska bakterioliza, imunska hemoliza, Jerne, CSC? Imunofluorescenčna reakcija (RIF) - nakazuje zaporedje dogodkov v neposredni Coonsovi reakciji; potrebne sestavine. Kaj je antigen, kaj je protitelo, kako so protitelesa označena, kako se upošteva rezultat reakcije, kako izgleda pozitiven rezultat? Praktična uporaba - kaj lahko določimo s to reakcijo? Posredna reakcija imunofluorescenca - navedite zaporedje dogodkov v tej reakciji, potrebne sestavine, kaj je antigen, kateri imunski serumi se uporabljajo; praktična uporaba; prednost indirektnega RIF pred neposredno reakcijo. Encimski imunski test (ELISA) - princip reakcije; potrebne sestavine; navesti zaporedje dogodkov pri postavitvi reakcije za odkrivanje antigena v testnem materialu; potrebne sestavine; kaj se zgodi s pozitivnim rezultatom, kako to izgleda? Določite zaporedje dejanj med ELISA testom za odkrivanje protiteles v testnem serumu; potrebne sestavine; kaj se zgodi s pozitivnim rezultatom? Imunobloting - princip reakcije; glavni koraki; potrebne sestavine; Kako se upošteva rezultat? koristi reakcije. Radioimunotest (RIA) - katere so glavne faze reakcije; s čim so označena protitelesa ali antigeni, kako se upošteva rezultat? Imuno elektronska mikroskopija– princip metode; glavni koraki; potrebne sestavine; S čim so označena protitelesa? kako se upošteva rezultat reakcije. Reakcije imobilizacije - princip metode, tehnika nastavitve, komponente, upoštevanje rezultatov.

Naloge za opravljanje v procesu samousposabljanja.

Izpolnite tabelo z reakcijami imunosti za reakcije, obravnavane v tej temi.

Imunske reakcije

Študentsko delo pri praktičnem pouku

Takoj začnite delati s formulacijo 1. faze RSC, vendar jo pozneje zapišite v zvezek (glej spodaj).

1. Reakcija imunske hemolize. Oglejte si demonstracijsko reakcijo imunske hemolize, jo narišite kot diagram, razložite rezultat v poskusni in kontrolni epruveti.

2. Reakcija vezave komplementa

a) razstavite RSC v skladu s tabelo;

b) v zvezek narišite shemo za nastavitev RSC v obliki tabele;

c) postavite drugo fazo RSK (prva faza je postavljena na začetek lekcije);

d) razstaviti diagnostične pripravke, potrebne za RSK;

e) upoštevajte rezultat. Oblikujte sklep o prisotnosti specifičnih protiteles v testiranem serumu.

3. Imunofluorescenčna reakcija. Preučite tabelo, sestavite shemo za nastavitev reakcije v zvezku; glej diagnostične serume; ugotoviti, kaj vsebuje serum, kako je pripravljen, za katero reakcijo (direktno ali indirektno RIF) se uporablja. Poglejte demonstracijski rezultat RIF v fluorescentnem mikroskopu.

4. Encimski imunski test (ELISA). V svoj zvezek sestavite reakcijsko shemo v dveh različicah: za dokazovanje antigena v testnem materialu in za dokazovanje protiteles v serumu. Preglejte komplet sestavin za diagnozo HIV in hepatitisa B. Ugotovite, kaj vsebuje posamezna sestavina in za kaj se uporablja.

5. Imunobloting. Narišite diagram reakcije v zvezek; glej demo - rezultat reakcije.

6. Radioimunski test (RIA). V zvezek nariši reakcijsko shemo.

7. Imunska elektronska mikroskopija (IEM). Oglejte si demonstracijo - rezultat reakcije, sestavite reakcijsko shemo v zvezek, s puščicami označite antigen (virus) in označena protitelesa.

Imunobloting je zelo občutljiva metoda odkrivanja beljakovin, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA. Imunoblotting se uporablja kot diagnostična metoda z okužbo s HIV itd.

V splošnem razumemo imunobloting kot analizo mešanice proteinov, prenesenih na trdno nosilno membrano, s katero se vežejo s kovalentnimi vezmi, čemur sledi imunodetekcija.

Možno je analizirati mešanico proteinov, nanesenih neposredno na substrat (dot blot analiza) ali po njeni predhodni frakcioniranju z elektrofokusiranjem, disk elektroforezo ali dvodimenzionalno elektroforezo (Western blot).

Antigene patogenov ločimo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato prenesemo iz gela na aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in razvijemo z ELISA.

Podjetja proizvajajo takšne trakove z "blots" antigenov. Na te trakove se nanese bolnikov serum. . Nato po inkubaciji bolnika speremo z nevezanih protiteles bolnika in nanesemo serum proti humanim imunoglobulinom, označenim z encimom. . Kompleks, ki nastane na lističu (antigen + protitelo bolnika + protitelo proti humanim Ig), se detektira z dodajanjem kromogenega substrata, ki pod delovanjem encima spremeni barvo.

Ta metodologija se uporablja tudi za selekcijo klonov bakterij, fagov ali virusov, ki izražajo produkte ciljnih kloniranih genov.

Prenos proteinov na membrano se izvaja bodisi pasivno bodisi z uporabo aparatov za elektrotransfer. Na učinkovitost prenosa proteinov na membrano vpliva veliko dejavnikov, kot so molekulska masa proteinov, poroznost gela, čas prenosa in sestava uporabljene puferske raztopine (trans pufer).

Glede na naloge in pogoje eksperimenta se izberejo pogoji prenosa, ki zagotavljajo najboljše rezultate. Substrati, ki se običajno uporabljajo, so nitroceluloza, poliviniliden difluorid (PVDF) ali pozitivno nabite najlonske membrane. Nitroceluloza lahko veže do 80-100 mikrogramov beljakovin na 1 cm2.

Beljakovine z nizko molekulsko maso (z molekulsko maso manj kot 20 kDa) se lahko izgubijo zaradi izpiranja, kar omogoča predhodno študijo polimorfizma določenih genetskih lokusov z dolžinami ustreznih restrikcijskih fragmentov DNA.

Poleg tega je z uporabo južne hibridizacije enostavno ugotoviti, ali ima ciljni gen v svojem notranjem delu mesto hidrolize z določenim restrikcijskim encimom, kar vam omogoča izbiro optimalne strategije za kloniranje regije preučevanega genoma.

Po podobni shemi lahko molekule RNK prenesemo tudi iz agaroznega gela v nitrocelulozni filter. Ta metoda je bila imenovana Northern blotting v nasprotju z Southern blottingom, saj priimek Southern v angleški jezik pomeni "južni".

Prenos na filtre iz proteinskega gela je bil zato imenovan Western blotting. Veliki proteini (večji od 100 kDa), denaturirani v raztopini natrijevega dodecil sulfata (SDS), se lahko slabo prenesejo na membrano, če je v trans pufru prisoten etanol. Alkohol bistveno izboljša prenos proteinov iz SDS-poliakrilamidnega gela, vendar zoži pore v gelu, kar povzroči zadrževanje velikih proteinov.

Membrana PVDF je optimizirana za imunsko detekcijo in lahko zadrži specifično vezane proteine ​​do 160 µg/cm2 z zelo nizko stopnjo nespecifične vezave.

Imunobloting

Pomembna lastnost te membrane je možnost njene večkratne uporabe. Najlonske membrane Zeta-Probe učinkovito vežejo proteine ​​SDS v odsotnosti alkohola in ta vezava je odporna na nadaljnje obdelave. Učinkovito se ohranijo tudi beljakovine z nizko molekulsko maso. Z visoko vezavno zmogljivostjo približno 480 μg beljakovin na 1 cm2 membrane Zeta-Probe omogočajo zaznavanje sledi beljakovin v testnih mešanicah.

Ko je antigen imobiliziran na membrani, se preostala vezavna mesta blokirajo z raztopino želatine, govejega serumskega albumina ali posnetega mleka.

Nato membrano inkubiramo v raztopini poliklonskih ali monoklonskih protiteles proti testiranemu antigenu. Po izpiranju nevezanih protiteles membrano inkubiramo v raztopini sekundarnih protiteles, ki so konjugat encimov alkalne fosfataze (alkalna fosfataza, AP) ali hrenove peroksidaze (HRP) s protivrstnimi protitelesi (kozja protitelesa proti zajčjim, mišjim oz. humani imunoglobulini) ali proteini A (protein Staphylococcus aureus) ali G (protein Streptococcus sp.), ki imajo visoko afiniteto za Fc regijo imunoglobulinov.

Odkrivanje oblikovanih imunskih kompleksov se izvaja s kemično ali kemiluminiscenčno metodo. Substrati za kemijska reakcija pri uporabi konjugatov alkalne fosfataze uporabimo 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) ali tetrazolium blue (NBT), pri uporabi konjugatov hrenove peroksidaze pa 4-kloro-1-naftol in vodikov peroksid.

Zaradi encimskih reakcij se na membrani na mestu lokalizacije kompleksa antigen-protitelo oblikuje barvni trak ali madež.

Občutljivost te metode je 100 pg proteina pri uporabi konjugatov AP in 100-500 pg pri uporabi konjugatov HRP. Kemiluminiscenčna detekcija imunskih kompleksov lahko zazna manj kot 5 pg antigena. Načelo te metode je, da ko HRP reagira z vodikovim peroksidom in cikličnim diacilhidrazineluminolom, se oddaja svetloba pri valovni dolžini 428 nm, ki jo lahko posnamemo na fotoobčutljivem filmu.

Imunobloting reakcija (RI) je bila razvita na podlagi ELISA. Je najbolj specifična in občutljiva metoda imunokemijske analize. Imunobloting (iz angleškega blot - zmočiti, pik) združuje ELISA z elektroforezo. Uporablja se za odkrivanje ne kompleksnih protiteles proti HIV, temveč protiteles proti njegovim posameznim strukturnim proteinom (proteini-p24, glikoproteini-gp120, gp 41 itd.). Za diagnozo okužbe s HIV se obrnite na strokovne (potrditvene) reakcije.

Reakcija poteka v več fazah:

Virus se uniči na komponente - antigene (p24, gp120, gp 41 itd.), Ki se podvržejo elektroforezi v poliakrilamidnem gelu, to je ločevanju antigenov na frakcije po molekulski masi.

2. Gel je prekrit z nitrocelulozno membrano in vanj z elektroforezo prenesemo frakcije antigena. Nitroceluloza se obnaša kot vpijalni papir. Membrana je razrezana na trakove (trakove). Podjetja proizvajajo takšne trakove z "blots" antigenov.

Imunobloting - dodatna posredna metoda

Trakovi z nanesenimi antigeni HIV se potopijo v serum subjekta in nato sperejo z nevezanega materiala.

4. Trakove inkubiramo z antiglobulinskim serumom, označenim s peroksidazo, in speremo.

Doda se substrat in zabeleži število barvnih frakcij (lis), ki ustrezajo območju lokalizacije kompleksa AG-AT.

Prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu. Rezultat imunoblotinga velja za pozitivnega, če so na membrani vidni pasovi, ki ustrezajo katerim koli dvema od treh antigenov HIV - p24, gp41 in gp 120 (slika 37).

RISBE

SEZNAM UPORABLJENE LITERATURE

Glavna literatura

Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija: učbenik za študente medicine. univerze 2. izd., popr. in dodatno — 702 str. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologija, virologija in imunologija: vodnik za laboratorijske študije: študijski vodnik / (V.B. Sboychakov et al.); izd. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 str.: ilustr.

3. Medicinska mikrobiologija, imunologija in virologija [Elektronski vir]: učbenik za med.

univerze - 760 str. — Način dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburg: Spetslit, 2010.

4. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija [Elektronski vir]: učbenik: v 2 zvezkih / V. 1. - 448 str. — Način dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Media, 2010. .

5. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija [Elektronski vir]: učbenik: v 2 zv., 2. zvezek - 480 str. Način dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

dodatno literaturo

1. Imunodiagnostične reakcije: vadnica/ sestavili: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtariyeva, M.M.

Khusnarizanova, Yu. Z. Gabidullin, M. M. Alsynbaev - Ufa: Založba GBOU VPO BSMU Ministrstva za zdravje Rusije, 2016. - 86 str.

2. Značilnosti nekaterih lastnosti, ki določajo patogeni potencial sokultiviranih variacij bakterij Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus: znanstvena publikacija / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Domov » Immunoblot - kaj je to? Imunoblot v diagnostiki nalezljive bolezni

Imunoblot - kaj je to? Imunoblot pri diagnostiki nalezljivih bolezni

Kaj je imunoblot? To je običajna laboratorijska diagnostična metoda. virusne okužbe oseba. Je eden najbolj natančnih in zanesljivih načinov za ugotavljanje prisotnosti HIV.

Za zanesljivost je celo večji od encimsko sklopljenega imunskega testa (elisa). Rezultati imunoblota veljajo za dokončne in dokončne. Splošne informacije

Imunoblot - kaj je to? Da bi osebo prepoznali kot HIV pozitivno, morate opraviti laboratorijski test za ugotavljanje prisotnosti protiteles v krvnem serumu.

Metoda Western blot presekov se imenuje tudi Western blot (western blot). Uporablja se za odkrivanje človeških virusnih okužb kot dodatna ekspertna metoda. To je potrebno za potrditev ELISA - laboratorijskega testa, ki vam omogoča ugotavljanje prisotnosti protiteles proti HIV v krvi. Imunoblot ponovno preveri pozitiven test ELISA.

Velja za najbolj občutljivo, zapleteno in drago.

Tarča

Kaj je imunoblot? Ta metoda laboratorijskega testiranja krvnega seruma za prisotnost protiteles proti virusu.

Med posebnimi študijami skupnih virusnih proteinov v gelu in na nitroceluloznih membranah.

Imunobloting (odkrivanje protiteles v serumu bolnikov proti določenim antigenom patogena)

Postopek Western blot sekcije je namenjen ugotavljanju okužbe s HIV različnih stopnjah. V prvem koraku se očiščen virus iz njegovih sestavnih delov podvrže elektroforezi in antigeni, ki so v njem, deljeni z molekulsko maso.

Virus človeške imunske pomanjkljivosti se razmnožuje v živih celicah, vgrajenih v njegove genetske informacije. Na tej stopnji oseba postane nosilec virusa HIV, če ste bili okuženi.

Posebnost te bolezni je, da za dolgo časa se ne prikaže. Virus uniči limfocite, zato se imuniteta osebe zmanjša in telo se ne more boriti proti okužbam.

Če se HIV zdravi pravilno in pravočasno, bo bolnik dočakal visoko starost. Pomanjkanje zdravljenja neizogibno vodi v smrt. Od trenutka okužbe, vendar brez zdravljenja, najdaljše obdobje ni več kot deset let.

Posebnosti

Imunoblot analiza je zanesljiva metoda, ki vam omogoča ugotavljanje prisotnosti protiteles proti antigenom HIV prve in druge vrste.

Če je oseba okužena, po dveh tednih protiteles, ki jih je mogoče odkriti veliko kasneje. Značilnost HIV je, da se količina protiteles hitro poveča in ostane v bolnikovi krvi. Tudi če so prisotni, se bolezen morda ne manifestira dve ali več let. Metoda ELISA ne kaže vedno natančno prisotnosti bolezni, zato je potrebna potrditev rezultatov PCR in Western blot odsekov, če je encimski imunski test pokazal pozitiven rezultat.

Indikacije za

Kakšen "imunoblot" je že odkrit, a se uvaja v študijo?

Razlog za testiranje imunoblota na virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) bo pozitiven rezultat ELISA. Pri bolnikih, ki so tik pred operacijo, je treba opraviti encimski imunski test. Poleg tega morate opraviti analizo žensk, ki načrtujejo nosečnost, in tistih, ki so promiskuitetne. Western blot rezine se dajo bolnikom z okužbo s HIV, če so rezultati elise dvomljivi.

Naslednji zaskrbljujoči simptomi so lahko razlog za obisk zdravnika: hitro hujšanje; šibkost, izguba delovanja; črevesne motnje (driska), ki traja tri tedne; dehidracija; vročina; povišana telesna temperatura. bezgavke v telesu; razvoj kandidiaze, tuberkuloze, pljučnice, toksoplazmoze, poslabšanje herpesa.

Bolniku se pred jemanjem ni treba pripravljati venske krvi.

Ne jejte 8-10 ur pred testom. Dan pred krvodajalstvom ni priporočljivo piti alkohola in kave, težkih telesnih vaj, vznemirjenja.

Kje opraviti analizo?

Kje se lahko testiram na HIV?

ELISA, imunoblot analiza, ki se izvaja v mestnih zasebnih klinikah, daje rezultate v enem dnevu. Možna je tudi takojšnja diagnoza. V javnih ustanovah so medicinski testi ELISA in Western blot odseki brezplačni v skladu z zakonodajo Ruske federacije.

Obvezen pregled za nalezljive bolezni nosečnic in bolnikov, ki potrebujejo hospitalizacijo ali operacijo. Kako poteka ta študija?

Kako opraviti ELISA? Imunoblot pozitiven/negativen potrdi ali ovrže rezultate elise. Postopek je precej preprost. Specialist odvzame vensko kri, čas traja manj kot pet minut.

Po vzorčenju je treba mesto vboda razkužiti in zalepiti z obližem. Vzorčenje se izvaja na prazen želodec, zato po posegu ne škodi, če pojemo tablico temne čokolade ali sladko toplo pijačo.

Če želite dobiti napotnico za brezplačno analizo v javni zdravstveni ustanovi, morate obiskati terapevta.

Na splošno se imunoblot po vzorčenju ne razlikuje od drugih krvnih preiskav. Metodologija raziskave je preprosta. Če je virus prisoten v človekovi krvi, telo začne proizvajati protitelesa, da ga uniči. Za vsak virus obstaja veliko proteinskih antigenov. Odkrivanje teh protiteles je osnova metode Western blot sekcije. Cena

Koliko analize? Imunoblot HIV se nanaša na poceni raziskave.

V povprečju se presejalne imunske metode gibljejo od 500 do 900 rubljev. Western blot odseki so študijski pregled, katerega stroški se gibljejo od tri do pet tisoč rubljev. Bolj zapletene metode so veliko dražje. Na primer, za analizo verižne reakcije s polimerazo (PCR) boste morali plačati približno 12.000 rubljev.

Interpretacija rezultatov

Najpogostejši metodi za diagnosticiranje okužbe s HIV sta encimski imunski test in imunoblot.

Namenjeni so določanju serumskih protiteles proti virusu humane imunske pomanjkljivosti. Okužbo običajno potrdimo z dvema testoma: presejalnim in potrditvenim. Razlago rezultatov mora opraviti zdravnik, on diagnosticira in predpisuje zdravljenje. Če je imunoblot pozitiven, to pomeni, da Človeško telo virus.

Pozitiven rezultat ne sme biti razlog za samozdravljenje, saj ima lahko vsak bolnik svojo sliko bolezni.

Kvalitativna analiza vključuje presejanje in certificiranje. Če bolnik nima virusa, je rezultat "negativen". Ko se to potrdilo najde, se izvedejo dodatni presejalni testi. Imunoblot analiza, ki potrdi ali ovrže presejanje. Če se testni trakovi pojavijo v zatemnitvi določenih območij (lokalizacija beljakovin), je diagnoza "HIV".

Če so rezultati dvomljivi, se testi opravijo v treh mesecih.

Da bi preprečili okužbo z virusom človeške imunske pomanjkljivosti, je mogoče, če upoštevate določena pravila: izogibajte se priložnostnim spolnim stikom, med stikom uporabljajte kondome, ne uporabljajte drog.

Če se bolezen odkrije pri nosečnici, je pomembno upoštevati priporočila lečečega zdravnika, ne pozabite na teste za prisotnost virusa.

Kaj je Western blotting?

Identifikacija proteinov v kompleksnih mešanicah ali izvlečkih različnih tkiv je eden od pogostih problemov. Z uporabo takšnega orodja, kot so specifična protitelesa, je mogoče določiti beljakovino, ki se proučuje, z minimalnimi časovnimi in finančnimi stroški.

Pri Western blotting metodi se na prvi stopnji mešanica proteinov loči z elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (SDS), nato pa se z elektroblotom prenese na nitrocelulozno membrano.

Bistvo te metode je v tem, da se gel po elektroforezi namesti na nitrocelulozno membrano med plasti filtrirnega papirja. Tako sestavljen »sendvič« postavimo v električno polje, da se kompleksi protein-SDS premikajo po gelski plošči in se imobilizirajo (zaradi nespecifične sorpcije) na površini nitrocelulozne membrane.

Pri vezavi kompleksa protein-SDS na nitrocelulozno membrano sodelujejo predvsem električne sile, ta interakcija pa je večtočkovna in vodi do »širjenja« proteinov po površini membrane. Tako po elektrotransferju dobimo repliko gela na nitrocelulozi z enako razporejenimi proteini kot v poliakrilamidnem gelu.

Po SDS - elektroforezi, elektrotransferu in sorpciji proteinov iz gela na nitrocelulozno membrano se terciarna konformacija proteina močno spremeni, če je na splošno pravilno govoriti o obstoju terciarne strukture proteina po tako ostri obdelavi. . Zato se za imunokemično detekcijo proučevanega proteina običajno uporabljajo samo mono- ali poliklonska protitelesa, specifična za linearne regije proteinske molekule.

51. Encimski imunski test, imunobloting. Mehanizem, komponente, uporaba.

Protitelesa, specifična za konformacijske epitope (ali mesta, ki vključujejo stike med podenotami), na splošno niso primerna za uporabo v Western blot metodi.

Po prenosu proteina se membrana zaporedno inkubira s protitelesi, specifičnimi za proučevani protein, in nato s sekundarnimi protitelesi, specifičnimi za Fc fragmente primarnih protiteles, konjugiranih z encimsko (ali kakšno drugo) oznako (sl.

1 A). V primeru, da so primarna protitelesa, specifična za proučevani antigen, neposredno konjugirana z oznako, sekundarna protitelesa niso potrebna (slika 1 B). Imunski kompleksi, ki nastanejo na mestu proučevane lokalizacije proteina, se "manifestirajo" s pomočjo kromogenega substrata (odvisno od vrste oznake).

Občutljivost in specifičnost metode je močno odvisna od tega, katera protitelesa se uporabljajo v študiji.

Uporabljena protitelesa morajo biti specifična za edinstveno aminokislinsko zaporedje, ki je specifično samo za proučevano beljakovino. V nasprotnem primeru je možna interakcija (predvsem v primeru grobih proteinskih izvlečkov) protiteles z več proteinskimi molekulami, kar bo posledično povzročilo pojav več barvnih trakov na membrani.

Identifikacija proučevanega proteina je v tem primeru pogosto težavna ali celo nemogoča.

Drugi pomemben dejavnik, ki ga morate upoštevati pri izbiri protiteles, je afiniteta. Večja ko je afiniteta uporabljenih protiteles, svetlejši in jasnejši so proteinski trakovi, večja je občutljivost metode. Pri uporabi protiteles z visoko afiniteto lahko dosežemo občutljivost 1 ng in celo več.

Za vizualizacijo rezultata interakcije membransko vezanega antigena in protiteles se uporabljajo sekundarna protitelesa, konjugirana s sredstvi, ki lahko pod določenimi pogoji dajo določen signal.

Običajno se kot takšno sredstvo uporablja encim (peroksidaza ali fosfataza), katerega reakcijski produkt ima barvo in se obori na membrani v obliki netopne oborine.

Pri tej metodi je mogoče uporabiti tudi fluorescentne nalepke.

riž. 1. Shema imunokemijskega obarvanja proučevanega proteina: A - z uporabo sekundarnih protiteles, konjugiranih z encimsko oznako; B - primarno protitelo je neposredno konjugirano z encimsko oznako.

Protokol:

I. Priprava gela in membrane ter elektroprenos beljakovin

Poliakrilamidni gel po elektroforezi smo dali v kopel s pufrom za popivnanje (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol).

Na del kasete, ki bo obrnjen proti anodi, položite dva lista filtrirnega papirja, izrezana v obliki kasete za vpijanje in navlažena s pufrom za vpijanje. Nato na filtrirni papir položimo nitrocelulozno membrano, predhodno navlaženo z istim pufrom, pri čemer pazimo, da med membrano in papirjem ni zračnih mehurčkov.

Po tem je treba gel previdno položiti na membrano, pri čemer moramo biti še posebej pozorni na odsotnost zračnih mehurčkov med gelom in membrano. Sendvič zaključujeta dve plasti navlaženega filtrirnega papirja, ki ju položimo na površino gela (slika 2). Nastali sendvič vpnemo v kaseto in postavimo med elektrode tako, da je membrana obrnjena proti anodi.

riž. 2. Shema elektroprenosa proteinov na membrano.

II. elektrotransfer

Elektroprenos proteinov na nitrocelulozno membrano se izvaja v pufru, ki vsebuje 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol 30–50 minut pri konstantni napetosti 100 V.

Čas elektrotransfera je odvisen od velikosti prenesenih proteinov, večji kot je protein, dlje traja elektrotransfer. Kakovost elektrotransporta in razporeditev proteinskih trakov ocenimo z barvanjem nitrocelulozne membrane z 0,3% raztopino Ponceau S v 1% ocetna kislina. Pred imunskim barvanjem je treba membrano večkrat sprati z blago alkalno vodno raztopino Tris, da odstranimo barvilo, vezano na beljakovine.

III. Imunokemijsko obarvanje proteinov, imobiliziranih na nitrocelulozni membrani

Za blokiranje nespecifičnih vezavnih mest za protitelesa se membrana inkubira ob stalnem mešanju pri sobni temperaturi 30 minut v PBST (za boljše blokiranje lahko uporabimo raztopino PBST, ki vsebuje 10 % posnetega mleka v prahu).

Po blokadi membrano eno uro inkubiramo pri sobni temperaturi ob stalnem mešanju v PBST, ki vsebuje 1-10 μg/ml specifičnih protiteles.

Optimalna koncentracija protiteles je izbrana empirično in je odvisna od afinitete interakcije protiteles z antigenom.

Ob koncu inkubacije smo membrano 5-krat sprali s PBST in jo prenesli v raztopino sekundarnih protiteles, konjugiranih s hrenovo peroksidazo. Redčenje konjugata običajno navede proizvajalec na embalaži ali pa jo raziskovalec izbere empirično. Membrano inkubiramo 1 uro v raztopini sekundarnih protiteles ob stalnem mešanju.

Po temeljitem izpiranju (vsaj 5-6 spremembah pufra) se membrana PBST prenese v raztopino kromogenega substrata, ki vsebuje 3 mg diaminobenzidina (DAB) in 10 µl 30 % vodikovega peroksida v 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6. .

Inkubacijo izvajamo ob mešanju 5 do 10 minut. Po končani inkubaciji s substratom je treba membrano sprati s PBST, posušiti s filtrirnim papirjem in takoj narediti elektronsko kopijo z barvnim skeniranjem. Če se membrana popolnoma posuši, pobarvani proteinski trakovi zbledijo, slika pa je manj svetla in kontrastna.

Opomba: DAB je strupen in potencialno rakotvoren. Delajte samo z gumijastimi rokavicami!

Po priporočilu SZO se pri diagnostiki okužbe s HIV uporablja imunobloting (western blot) kot dodatna strokovna metoda, ki naj potrdi rezultate testa ELISA. Ta metoda se običajno uporablja za dvojno preverjanje pozitivnega rezultata ELISA, saj velja za bolj občutljivo in specifično, čeprav je bolj zapletena in dražja.

Imunobloting združuje encimski imunski test (ELISA) s predhodno elektroforetično ločitvijo virusnih proteinov v gelu in njihovim prenosom na nitrocelulozno membrano. Imunoblot postopek je sestavljen iz več korakov (slika 27). HIV, predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, ki sestavljajo virus, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem antigeni prenesejo iz gela na trak iz nitroceluloze ali najlonski filter, ki zdaj vsebuje očesu neviden spekter proteinov, ki je značilen za HIV. Nato se na trak nanese testni material (serum, plazma bolnika itd.) in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na trakove antigenskih proteinov, ki jim strogo ustrezajo. Kot rezultat kasnejših manipulacij (kot je ELISA) je rezultat te interakcije vizualiziran – viden. Prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Imunobloting se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. WHO meni, da so serumi pozitivni, če se z imunoblotingom odkrijejo protitelesa proti katerim koli dvema proteinoma ovojnice HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od ovojnih proteinov (

V Rusiji je trenutno standardni postopek laboratorijske diagnoze okužbe s HIV odkrivanje protiteles proti HIVz uporabo encimskega imunskega testa sledi potrditev njihove specifičnosti v reakciji imunski bloting.

Protitelesa proti HIV se pojavijo pri 90-95% okuženih v 3 mesecih po okužbi, pri 5-9% - po 6 mesecih od trenutka okužbe in pri 0,5-1% - pozneje. Najzgodnejši čas za odkrivanje protiteles je 2 tedna od trenutka okužbe.

Odkrivanje protiteles proti HIV vključuje 2 stopnji. Na prvi stopnji Odkrivanje celotnega spektra protiteles proti antigenom HIV se izvaja z različnimi testi: encimski imunski test, aglutinacija, kombinirani, glavnik, membranski filter ali membransko difuzni. Na drugi stopnji imunobloting uporabljamo za določanje protiteles proti posameznim proteinom virusa. Pri delu je dovoljeno uporabljati samo testne sisteme, ki imajo dovoljenje za uporabo Ministrstva za zdravje Ruske federacije. Diagnostične postopke je treba izvajati le v skladu z odobrenimi navodili za uporabo ustreznih testov.

Vzorčenje krvi iz kubitalne vene v čisto, suho epruveto v količini 3-5 ml. Novorojenčkom se lahko odvzame popkovnična kri. Pridobljenega materiala (polne krvi) ni priporočljivo hraniti več kot 12 ur pri sobni temperaturi in več kot 1 dan v hladilniku pri 4-8°C. Prihajajoča hemoliza lahko vpliva na rezultate analize. Serum ločimo s centrifugiranjem ali s sledenjem krvi po steni epruvete s Pasteurjevo pipeto ali stekleno paličico. Izločen serum prenesemo v čisto (po možnosti sterilno) epruveto, vialo ali plastično posodo in ga v takšni obliki hranimo do 7 dni pri temperaturi 4-8°C. Pri delu morate upoštevati varnostna pravila, navedena v "Navodilih o protiepidemičnem režimu v diagnostičnih laboratorijih za aids" št. 42-28 / 38-90 z dne 5. julija 1990.

Določanje skupnih protiteles proti HIV.

Po prejemu prvega pozitivnega rezultata se analiza izvede še 2-krat (z istim serumom in v istem testnem sistemu). Če je bil dosežen vsaj en pozitiven rezultat (dva pozitivna rezultata od treh ELISA testov), ​​se serum pošlje v referenčni laboratorij.

V referenčnem laboratoriju primarno pozitivne serume (tj. tiste, ki so dali dva pozitivna rezultata v prvem testnem sistemu) ponovno pregledamo v ELISA v drugem (drugem) testnem sistemu, izbranem za potrditev.

Po prejemu pozitivnega rezultata analize v drugem testnem sistemu je treba serum pregledati v IS.

Če je v drugem testnem sistemu negativen rezultat, se serum ponovno pregleda v tretjem testnem sistemu.

Če je rezultat testa negativen v drugem in tretjem testnem sistemu, se izda sklep o odsotnosti protiteles proti HIV.

Ko dobimo pozitiven rezultat v tretjem testnem sistemu, se serum pošlje tudi v analizo pri imunskem blotingu.

imunski bloting.

Načelo metode je odkrivanje protiteles proti določenim proteinom virusa, imobiliziranim na nitrocelulozni membrani. Proteini ovojnice (env) HIV-1 se običajno imenujejo glikoproteini ("gp" ali "gp"), z molekulsko maso, izraženo v kilodaltonih (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. Pri HIV-2 imajo glikoproteini težo 140 kd, 105 kd, 36 kd. Jedrni proteini (gag) (običajno imenovani proteini - "p" ali "r") v HIV-1 imajo molekulsko maso 55 kd, 24 kd, 17 kd, HIV-2 pa -56 kd, 26 kd , 18 kd. Encimi HIV-1 (pol) imajo molekulsko maso 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd.

Rezultati imunoblotinga se razlagajo kot pozitivni, nedoločeni in negativni.

pozitivno(pozitivni) se štejejo vzorci, v katerih so dokazana protitelesa proti 2 ali 3 glikoproteinom HIV.

negativno(negativni) so serumi, ki ne zaznajo protiteles proti nobenemu od antigenov (proteinov) HIV.

Upoštevani so vzorci, ki zaznajo protitelesa proti enemu glikoproteinu HIV in/ali kateremu koli proteinu HIV. dvomljivo(nedefinirano ali nerazumljivo).

Ko dobimo nedoločen rezultat s protitelesi proti jedrnim proteinom (gag) v imunskem blotu z antigeni HIV-1, opravimo test z antigeni HIV-2.

Po prejemu pozitivnih rezultatov imunskega blotinga se sklepa o prisotnosti protiteles proti HIV v testnem materialu.

Po prejemu negativnega izvida testa IB izda sklep, da protiteles proti HIV ni.

Po prejemu nedoločenega rezultata (če antigen p24 ni bil odkrit) se po 3 mesecih izvedejo ponovni testi za protitelesa proti HIV,

in ob ohranjanju nedoločenih rezultatov po nadaljnjih 3 mesecih. Če je bil odkrit antigen p24, se drugi pregled opravi 2 tedna po prejemu prvega nedoločenega rezultata.

Če se 6 mesecev po prvem pregledu ponovno dobijo nedoločljivi rezultati in bolnik nima dejavnikov tveganja za okužbo in kliničnih simptomov okužbe s HIV, se rezultat šteje za lažno pozitiven. (Če obstajajo epidemiološke in klinične indikacije, se serološke študije ponovijo, kot je predpisano).

Imunski bloting z uporabo rekombinantnih za virus specifičnih polipeptidov "HIV blot" se razlikuje po tem, da ne uporablja samih virusnih proteinov, temveč rekombinantne polipeptide - analoge HIV antigenov ("Env1", "Gag1", "Poll", "Env2"). Rekombinantni polipeptid Env1 zaznava protitelesa neposredno proti HIV-1 gp120 in gp41, polipeptid Gag1 proti antigenoma p17 in p24, polipeptid Po11 proti antigenu p51, polipeptid Env2 proti antigenoma HIV-2 gp110 in gp38. Serum velja za pozitivnega, če reagira z Env1 ali Env2 ali obema Env (dvojna okužba s HIV tipa 1 in 2). Reakcija samo s Poll in Gag se šteje za nedoločen rezultat, v tem primeru se spremljanje izvaja podobno kot pri nedoločenih rezultatih klasičnega imunoblota z uporabo HIV lizata.

Posebnosti serološke diagnoze okužbe s HIV pri otrocih, rojenih od mater, okuženih s HIV, so, da imajo tako okuženi kot neokuženi otroci v prvih 6-12 mesecih življenja protitelesa proti HIV materinega izvora, ki lahko nato izginejo. Kriterij, ki kaže na prisotnost okužbe s HIV pri otroku, je odkritje protiteles proti HIV pri starosti 18 mesecev ali več. Odsotnost protiteles proti HIV pri 18-mesečnem otroku, ki ga je rodila mati okužena s HIV, je merilo proti okužbi s HIV.

IMUNOBLOT(western blot) - metoda laboratorijskega testiranja krvnega seruma na prisotnost protiteles proti HIV; je natančnejši test kot ELISA in se uporablja za potrditev rezultatov ELISA. ELISA - encimski imunski test (ELISA) - laboratorijske raziskave, ki omogoča ugotavljanje prisotnosti protiteles proti HIV v krvi; Test protiteles proti HIV.

Po priporočilu SZO se pri diagnostiki okužbe s HIV uporablja imunobloting (western blot) kot dodatna strokovna metoda, ki naj potrdi rezultate testa ELISA. Ta metoda se običajno uporablja za dvojno preverjanje pozitivnega rezultata ELISA, saj velja za bolj občutljivo in specifično, čeprav je bolj zapletena in dražja.

Imunobloting združuje encimski imunski test (ELISA) s predhodno elektroforetično ločitvijo virusnih proteinov v gelu in njihovim prenosom na nitrocelulozno membrano. Postopek imunoblota je sestavljen iz več faz (). HIV, predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, ki sestavljajo virus, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem antigeni prenesejo iz gela na trak iz nitroceluloze ali najlonski filter, ki zdaj vsebuje očesu neviden spekter proteinov, ki je značilen za HIV. Nato se na trak nanese testni material (serum, plazma bolnika itd.) in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na trakove antigenskih proteinov, ki jim strogo ustrezajo. Kot rezultat kasnejših manipulacij (kot je ELISA) je rezultat te interakcije vizualiziran – viden. Prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Imunobloting se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. WHO meni, da so serumi pozitivni, če se z imunoblotingom odkrijejo protitelesa proti katerim koli dvema proteinoma ovojnice HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od proteinov ovojnice (gp160, gp120, gp41) v kombinaciji z ali brez reakcije z drugimi proteini, se rezultat šteje za dvomljiv in se priporoča druga študija z uporabo kompleta iz druge serije ali drugega podjetja. Če po tem rezultat ostane dvomljiv, se študije nadaljujejo vsake 3 mesece.

Pri imunoblotingu se na prvi stopnji beljakovine v krvnem serumu ločijo v gelu glede na njihovo molekulsko maso in naboj z električnim poljem (metoda gelske elektroforeze). Nato se na gel nanese nitrocelulozna ali najlonska membrana in jo "namoči" (to je blotting). To poteka v posebni komori, ki omogoča popoln prenos materiala iz gela na membrano. Posledično se vzorec razporeditve beljakovin, ki je bil na gelu, reproducira na membrani (blot), ki jo je nato mogoče enostavno manipulirati. Sprva membrano obdelamo s protitelesi proti želenemu antigenu, po izpiranju nevezanega materiala pa dodamo radioaktivno označen konjugat, ki se specifično veže na protitelesa (kot pri ELISA). Lokacijo nastalega konjugiranega kompleksa antigen-protitelo določimo z avtoradiografijo z uporabo rentgenskega filma. Po njegovi manifestaciji postane vse jasno, ali so v krvi antigeni ali ne.