مناعي فيروس نقص المناعة البشرية. كيف يتم تشخيص الإيدز عن طريق اللطخة المناعية لفيروس نقص المناعة البشرية المناعي - ما هو؟ اللطخة المناعية في تشخيص الأمراض المعدية

تم تصميم مجموعة كاشف MPBA-Blot-HIV-1 و HIV-2 لتأكيد اكتشاف الأجسام المضادة للبروتينات الفردية (المستضدات) لفيروس HIV-1 و / أو مجموعة HIV-1 O و / أو HIV-2 في المصل أو البلازما دم الإنسانطريقة اللطخة المناعية.

السمات المميزة:

تحتوي مجموعة الكواشف "MPBA - Blot - HIV-1، HIV-2" على البروتينات الفيروسية المحللة المنقاة لـ HIV 1 والببتيد - يحدد مستضد HIV-2 gp36 ؛
يوفر الكشف عن الأجسام المضادة لـ HIV-1 و HIV-1 Group O و HIV 2 على شريط واحد ؛
إجراء بسيط لإعداد التحليلات وإجرائها ؛
مراقبة الجودة الداخلية للتفاعل *
السرعة القصوى للتحليل (3 ساعات) ؛
حجم صغير من عينة الاختبار - 20 ميكرولتر ؛
لا يتطلب معدات إضافية للبحث ؛
جودة المجموعة مضمونة باستخدام عينات قياسية روسية ودولية **

* يتم ضمان مراقبة الجودة الداخلية من خلال وجود:

شرائط التحكم الداخلية ، توفر التحكم في إدخال عينة من المصل أو البلازما ؛
السيطرة على المصل السلبي (K-) ؛
مصل التحكم الإيجابي (K +) ، والذي يسمح بتحديد العصابات المكتشفة على الشريط ؛
التحكم في المصل الإيجابي الضعيف (K + cl) ، والذي يوفر التحكم في حساسية مجموعة الكاشف.

**تاكيد الجودة:

تم تحديد خصائص مجموعة كاشف MPBA-Blot-HIV-1 و HIV-2 عن طريق اختبار عينات من عينة عشوائية من المتبرعين والمرضى الذين تم تشخيصهم عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، ولوحات التحويل المصلي التجارية ، والألواح القياسية ، والعينات ذات المكونات "التي يحتمل أن تتداخل".

لا تعطي مجموعة الكاشف نتائج إيجابية خاطئة في دراسة مصل اللوحة المعيارية التي لا تحتوي على أجسام مضادة لـ HIV 1.2 ومستضد HIV-1 ("Standard AT (-) HIV" ، رقم FSR 2007/00953 of 10 / 25/2007). الخصوصية - 100٪.

تم تحديد خصوصية التشخيص من خلال دراسة عينة عشوائية من 200 متبرع من مراكز وعيادات دم مختلفة مع غياب مؤكد مبدئي لعدوى HIV-1 و HIV-2. كانت الخصوصية في دراسة عينة عشوائية من المتبرعين 100٪ ؛

تم تحديد خصوصية مجموعة الكاشف في دراسة 250 عينة ، بما في ذلك عينات المصل أو البلازما التي تم الحصول عليها من النساء الحوامل والمرضى في المستشفى والمرضى المصابين بالتهاب الكبد C و E والعينات ذات المكونات "التي يحتمل أن تتدخل في التحديد". عند استخدام مجموعة MPBA-Blot-HIV-1 و HIV-2 ، لم يتم العثور على نتائج إيجابية كاذبة لهذه العينات.

تم تحديد الحساسية التشخيصية باستخدام:
- Boston Biomedica، Inc. عينات بلازما لوحة HIV-1 (WWRB 301) من مناطق مختلفة تحتوي على أنواع فرعية مختلفة من HIV-1: المجموعة M (الأنواع الفرعية A ، B ، C ، D ، E ، F) ، والمجموعة O ؛ كانت حساسية مجموعة الكاشف 100٪ ؛

تم تحديد حساسية مجموعة الكاشف في دراسة لوحات الانقلاب المصلي الدولية Boston Biomedica ، Inc (SeraCare Life Sciences) ، cat. nrs. PRB 903، PRB 904، PRB 909، PRB 912، PRB 916، PRB 917، PRB 918، PRB 919، PRB 921، PRB 923، PRB 924، PRB 927، PRB 928، PRB 932، PRB 940

تكتشف مجموعة الكواشف الأجسام المضادة لـ HIV-1 في مصل لوحة قياسية تحتوي على أجسام مضادة لـ HIV-1 ("معيار AT (+) HIV-1" ، رقم FSR 2007/00953 بتاريخ 25 أكتوبر 2007) ، ويكشف عن الأجسام المضادة إلى HIV-2 في مصل اللوحة المعيارية التي تحتوي على أجسام مضادة لـ HIV-2 ("معيار AT (+) HIV-2" ، رقم FSR 2007/00953 بتاريخ 10/25/2007). الحساسية - 100٪.

شهادة التسجيل رقم FSR 2010/07958 بتاريخ 13 يوليو 2011 (الصلاحية ليست محدودة)

مُجَمَّع:

ماص مناعي. شرائط غشاء النيتروسليلوز الأبيض مع بروتينات HIV-1 الفردية (gp160 ، gp120 ، p66 ، p55 ، p51 ، gp41 ، p31 ، p24 ، p17) يتم امتصاصها عليها بطريقة النقل الكهربائي ويتم تطبيقها على الشريط باستخدام ببتيد HIV-2 الاصطناعي ، نظير لبروتين gp36 ومضاد IgG بشري (تحكم داخلي) - 18 قطعة ؛
ك- السيطرة على المصل السلبي. يتم تعطيل مصل الدم البشري الذي لا يحتوي على أجسام مضادة لـ HIV-1،2 و HCV ومستضد HIV و HBsAg عن طريق التسخين عند 560 درجة مئوية ؛ سائل أصفر فاتح شفاف - أنبوب اختبار واحد (0.08 مل). يحتوي على مواد حافظة: ثيميروسال وأزيد الصوديوم ؛
K + - السيطرة على المصل الإيجابي. مصل دم بشري يحتوي على أجسام مضادة لـ HIV-1،2 (عيار لا يقل عن 1: 10000) ، لا يحتوي على HBsAg ، مستضد فيروس نقص المناعة البشرية ، أجسام مضادة لـ HCV ، معطل بالتسخين عند 560 درجة مئوية ؛ سائل أصفر فاتح شفاف - أنبوب اختبار واحد (0.08 مل) يحتوي على مواد حافظة: ثيميروسال وأزيد الصوديوم ؛
K + sl - التحكم في المصل الإيجابي الضعيف. مصل دم بشري يحتوي على أجسام مضادة لـ HIV-1،2 (عيار لا يزيد عن 1: 200) ، لا يحتوي على HBsAg ، مستضد فيروس نقص المناعة البشرية ، أجسام مضادة لـ HCV ، معطل بالتسخين عند 560 درجة مئوية ؛ سائل أصفر فاتح شفاف - أنبوب اختبار واحد (0.08 مل). يحتوي على مواد حافظة: ثيميروسال وأزيد الصوديوم ؛
RROKk (x10) - محلول لتخفيف العينات والمقارن. التركيز - محلول تريس الذي يحتوي على مصل الماعز الطبيعي المعالج مسبقًا ؛ سائل رمادي معتم - 1 قارورة (10 مل). يحتوي على مادة حافظة: ثيميروسال ؛
PRK (x20) - محلول الغسيل. التركيز - تريس عازلة تحتوي على توين -20 ؛ سائل شفاف عديم اللون - 1 قارورة (70 مل). يحتوي على مادة حافظة: ثيميروسال ؛
المترافقة. الأجسام المضادة للماعز لـ IgG البشري ، مترافقة مع الفوسفاتيز القلوي ؛ سائل شفاف عديم اللون - أنبوب اختبار واحد (0.06 مل) ؛
الركيزة (محلول التلوين). محلول 5-برومو-4-فلورو-إندوليل-فوسفات (BCIP) ونيتروزين تترازوليوم (NBT) ؛ سائل أصفر فاتح شفاف - 1 قارورة (50 مل) ؛
مسحوق ل النشاف المناعي. مسحوق الحليب منزوع الدسم - مسحوق أبيض غير متبلور أو أصفر فاتح - 5 عبوات × 1 جم ؛
قرص مع غطاء لإعداد رد فعل - قطعتان ؛
ملاقط بلاستيكية - قطعة واحدة.

التجلط المناعي -(من "البقعة" الإنجليزية) - طريقة لتحديد المستضدات (أو الأجسام المضادة) باستخدام الأمصال المعروفة (أو المستضدات). إنه مزيج من الرحلان الكهربائي للهلام مع ELISA. في البداية ، يتم تدمير الخلايا البكتيرية أو الفيروسات باستخدام الموجات فوق الصوتية ، ثم يتم فصل جميع مستضدات الفيروس أو الخلايا البكتيرية عن طريق الرحلان الكهربائي ويتم الحصول على كاشف تجاري على فيلم نيتروسليلوز خاص. عند إعداد التجلط المناعي ، يتم تطبيق مصل اختبار المريض على الفيلم الذي يحتوي على مستضدات معروفة. بعد حضانة وغسل الأجسام المضادة غير المقيدة ، ينتقلون إلى ELISA - يتم تطبيق مصل مضاد للجلوبيولين المناعي البشري المسمى بإنزيم وركيزة كروموجينيك التي يتغير لونها عند التفاعل مع الإنزيم على الفيلم. في وجود مستضد - جسم مضاد - مضاد لمجمعات إنزيم الغلوبولين المناعي ، تظهر بقع ملونة على الناقل. تسمح لك طريقة التجلط المناعي بالكشف بشكل منفصل عن الأجسام المضادة لمختلف مستضدات العامل الممرض (على سبيل المثال ، في عدوى فيروس العوز المناعي البشري ، يكتشف التجلط المناعي الأجسام المضادة لـ gp120 و gp24 ومستضدات أخرى للفيروس).

المقايسة المناعية الراديوية (RIA)

تعتمد الطريقة على تفاعل الجسم المضاد للمستضد باستخدام مستضد أو ملصق جسم مضاد مع النويدات المشعة. يتم استخدام 125I ، 14C ، 3H ، 51Cr والنويدات المشعة الأخرى كتسمية. يتم عزل المجمعات المناعية الناتجة عن النظام ويتم تحديد نشاطها الإشعاعي على عدادات (إشعاع). كثافة الإشعاع تتناسب طرديًا مع عدد جزيئات المستضد والأجسام المضادة المرتبطة.

يتم استخدام نسخة المرحلة الصلبة من RIA باستخدام الأجسام المضادة المسمى أو المستضدات الممتصة في آبار ألواح البوليسترين على نطاق واسع.

يستخدم RIA للكشف عن مستضدات الميكروبات والفيروسات والهرمونات المختلفة والإنزيمات ، المواد الطبية، الغلوبولين المناعي ، وكذلك المواد الأخرى الموجودة في مادة الاختبار بتركيزات طفيفة من 10-12-10-15 جم / لتر.

أسئلة الاختبار

تفاعل تحلل الجراثيم المناعي: ما هو نوع التفاعل ؛ ما هو المستضد ، ما هو الجسم المضاد ، آلية التفاعل ، طرق الإعداد ، التطبيق العملي. تفاعل انحلال الدم المناعي: المكونات الضرورية ، طريقة الإعداد ؛ الضوابط والتطبيق العملي. تفاعل انحلال الدم الموضعي في الهلام (تفاعل اليرن): مبدأ التفاعل ، طريقة الصياغة ، التطبيق العملي. تفاعل التثبيت التكميلي: مبدأ التفاعل ؛ ما يتكون عندما يتفاعل مصل المناعة مع مستضد معين ؛ ماذا يحدث لتكمل إذا كانت موجودة في هذا التفاعل؟ ما هو مصير المكمل إذا لم يكن هناك تقارب محدد بين المستضد والأجسام المضادة؟ ما هو رد الفعل الذي يمكن استخدامه لتحديد ما حدث للمكمل ؛ لماذا يتم استخدام هذا التفاعل؟ ما هو المرئي نتيجة ايجابية RSK؟ لماذا ا؟ ما هي خاصية التكملة المستخدمة في المرحلة الأولى من CSC؟ في المرحلة الثانية؟ إذا كانت النتيجة النهائية لـ RSK هي انحلال الدم ، فماذا يعني هذا - إيجابي أو نتيجة سلبية؟ اشرح النتائج: RSK + + + + ، RSK + + + ، RSK + + ، RSK +. قم بتسمية مكونات نظام RSK الأول ومكونات نظام RSK الثاني. لماذا يحتاج مصل الاختبار إلى التعطيل؟ كيف تتم معايرة التكملة؟ المصل الانحلالي: ماذا يحتوي ، كيف يتم الحصول عليه ، ما هو العيار وكيف يتم تحديده؟ ما الحيوانات المستخدمة للحصول على مكونات RSC؟ تقنية ضبط RSC في البرد. عند إجراء أي من التفاعلات التالية ، تكون مشاركة المكمل ضرورية: الترسيب ، التلبد ، التراص ، الكشف عن الأجسام المضادة غير الكاملة ، التحلل الجرثومي المناعي ، انحلال الدم المناعي ، Jerne ، CSC؟ تفاعل التألق المناعي (RIF) - يشير إلى تسلسل الأحداث في تفاعل Coons المباشر ؛ المكونات الضرورية. ما هو المستضد ، ما هو الجسم المضاد ، كيف يتم تصنيف الأجسام المضادة ، كيف يتم أخذ نتيجة التفاعل في الاعتبار ، كيف تبدو النتيجة الإيجابية؟ تطبيق عملي - ما الذي يمكن تحديده باستخدام هذا التفاعل؟ رد فعل غير مباشرالتألق المناعي - يشير إلى تسلسل الأحداث في هذا التفاعل ، والمكونات الضرورية ، وما هو المستضد ، وما هي الأمصال المناعية المستخدمة ؛ الاستخدام العملي؛ ميزة RIF غير المباشرة على التفاعل المباشر. المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA) - مبدأ التفاعل ؛ المكونات الضرورية الإشارة إلى تسلسل الأحداث عند إعداد تفاعل من أجل الكشف عن مستضد في مادة الاختبار ؛ المكونات الضرورية ماذا يحدث بالنتيجة الإيجابية ، كيف تبدو؟ تحديد تسلسل الإجراءات خلال ELISA للكشف عن الأجسام المضادة في مصل الاختبار ؛ المكونات الضرورية ماذا يحدث بالنتيجة الإيجابية؟ التجلط المناعي - مبدأ التفاعل ؛ الخطوات الرئيسية المكونات الضرورية كيف تؤخذ النتيجة في الاعتبار؟ فوائد رد الفعل. المقايسة المناعية المشعة (RIA) - ما هي المراحل الرئيسية للتفاعل ؛ ما هي الأجسام المضادة أو المستضدات التي تحمل علامة ، وكيف تؤخذ النتيجة في الاعتبار؟ مناعي المجهر الإلكتروني- مبدأ الطريقة ؛ الخطوات الرئيسية المكونات الضرورية ما هي الأجسام المضادة الموسومة؟ كيف تؤخذ نتيجة التفاعل في الاعتبار. تفاعلات التثبيت - مبدأ الطريقة ، تقنية الإعداد ، المكونات ، المحاسبة على النتائج.

المهام التي يجب القيام بها في عملية التدريب الذاتي.

أكمل جدول تفاعلات المناعة للتعرف على ردود الفعل التي تم تناولها في هذا الموضوع.

ردود الفعل المناعية

عمل الطالب في درس عملي

ابدأ العمل فورًا في صياغة المرحلة الأولى من RSC ، لكن اكتبها في دفتر ملاحظات لاحقًا (انظر أدناه).

1. تفاعل انحلال الدم المناعي. اعرض تفاعلًا توضيحيًا لانحلال الدم المناعي ، وارسمه كمخطط ، واشرح النتيجة في الأنابيب التجريبية والمراقبة.

2. تكملة رد فعل ملزم

أ) تفكيك RSC وفقًا للجدول ؛

ب) رسم مخطط في دفتر ملاحظات لوضع RSC في شكل جدول ؛

ج) ضع المرحلة الثانية من RSK (يتم وضع المرحلة الأولى في بداية الدرس) ؛

د) تفكيك الاستعدادات التشخيصية اللازمة لـ RSK ؛

ه) تأخذ في الاعتبار النتيجة. قم بصياغة استنتاج حول وجود أجسام مضادة معينة في مصل الاختبار.

3. تفاعل التألق المناعي. ادرس الجدول ، ارسم مخططًا لإعداد التفاعل في دفتر ملاحظاتك ؛ انظر الأمصال التشخيصية تحديد ما يحتويه المصل ، وكيف يتم تحضيره ، ولأي تفاعل (مباشر أو غير مباشر RIF) يتم استخدامه. انظر إلى نتيجة العرض التوضيحي لـ RIF في مجهر الفلورسنت.

4. الإنزيم المناعي (ELISA). في دفتر ملاحظاتك ، ضع مخطط تفاعل في نسختين: لاكتشاف مستضد في مادة الاختبار وللكشف عن الأجسام المضادة في المصل. راجع مجموعة مكونات تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي ب وحدد ما يحتويه كل مكون وما الغرض الذي يتم استخدامه من أجله.

5. التجلط المناعي. قم بعمل رسم تخطيطي لرد الفعل في دفتر ملاحظاتك ؛ انظر العرض - نتيجة رد الفعل.

6. المقايسة المناعية الراديوية (RIA). ارسم مخطط التفاعل في دفتر ملاحظاتك.

7. المجهر الإلكتروني المناعي (IEM). شاهد العرض التوضيحي - نتيجة التفاعل ، ارسم مخططًا للتفاعل في دفتر ملاحظاتك ، وقم بالإشارة إلى المستضد (الفيروس) والأجسام المضادة المصنفة بالسهام.

التجلط المناعي هو طريقة حساسة للغاية للكشف عن البروتين تعتمد على مزيج من الرحلان الكهربائي و ELISA أو RIA. يستخدم Immunoblotting كما طريقة التشخيصمع عدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، إلخ.

بشكل عام ، يُفهم التكتل المناعي على أنه تحليل خليط من البروتينات المنقولة إلى غشاء دعم صلب ، حيث ترتبط به روابط تساهمية ، يليها الكشف المناعي.

من الممكن تحليل مزيج من البروتينات المودعة مباشرة على ركيزة (تحليل لطخة نقطية) أو بعد تجزئتها الأولية عن طريق التركيز الكهربائي أو الرحلان الكهربائي للقرص أو الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد (النشاف الغربي).

يتم فصل المستضدات الممرضة عن طريق الرحلان الكهربي للهلام البولي أكريلاميد ، ثم يتم نقلها من الجل إلى الورق المنشط أو غشاء النيتروسليلوز ويتم تطويرها بواسطة ELISA.

تنتج الشركات مثل هذه الشرائط مع "بقع" من المستضدات. يتم وضع مصل المريض على هذه الشرائط. . ثم ، بعد الحضانة ، يتم غسل المريض من الأجسام المضادة غير المقيدة للمريض ويتم تطبيق المصل ضد الغلوبولين المناعي البشري المسمى بالإنزيم. . يتم الكشف عن المركب المتكون على الشريط (مستضد + جسم مضاد للمريض + جسم مضاد ضد Ig البشري) عن طريق إضافة ركيزة كروموجينية تغير لونها تحت تأثير الإنزيم.

يتم تطبيق هذه المنهجية أيضًا على اختيار استنساخ البكتيريا أو العاثيات أو الفيروسات التي تعبر عن منتجات الجينات المستنسخة المستهدفة.

يتم نقل البروتينات إلى الغشاء إما بشكل سلبي أو باستخدام جهاز النقل الكهربائي. تتأثر كفاءة نقل البروتين إلى الغشاء بالعديد من العوامل ، مثل الوزن الجزيئي للبروتينات ، ومسامية الهلام ، ووقت النقل ، وتكوين محلول العازلة (المخزن المؤقت العابر) المستخدم.

بناءً على مهام وشروط التجربة ، يتم تحديد شروط النقل التي توفر أفضل النتائج. الركائز المستخدمة بشكل شائع هي نيتروسليلوز ، بولي فينيلدين ثنائي فلوريد (PVDF) ، أو أغشية نايلون موجبة الشحنة. يمكن أن يرتبط النيتروسليلوز بما يصل إلى 80-100 ميكروغرام من البروتين لكل 1 سم 2.

يمكن أن تفقد البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض (التي يقل وزنها الجزيئي عن 20 كيلو دالتون) نتيجة للغسيل ، مما يجعل من الممكن إجراء دراسة أولية لتعدد الأشكال لمواضع وراثية معينة من خلال أطوال أجزاء الحمض النووي المقيدة المقابلة.

بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام التهجين الجنوبي ، من السهل معرفة ما إذا كان للجين المستهدف موقع تحلل مائي بواسطة إنزيم تقييد معين في الجزء الداخلي منه ، مما يسمح لك باختيار الإستراتيجية المثلى لاستنساخ منطقة الجينوم قيد الدراسة.

وفقًا لمخطط مماثل ، يمكن أيضًا نقل جزيئات الحمض النووي الريبي من هلام الاغاروز إلى مرشح النيتروسليلوز. سميت هذه الطريقة بالنشاف الشمالي بدلاً من النشاف الجنوبي ، منذ اللقب الجنوبي في اللغة الإنجليزيةتعني "الجنوب".

تم استدعاء النقل إلى المرشحات من جل البروتين وفقًا لذلك النشاف الغربي. قد يتم نقل البروتينات الكبيرة (أكبر من 100 كيلو دالتون) المشوهة في محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) بشكل سيئ إلى الغشاء إذا كان الإيثانول موجودًا في المخزن المؤقت العابر. يحسن الكحول بشكل كبير نقل البروتينات من هلام SDS-polyacrylamide ، ولكنه يضيق المسام في الجل ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالبروتينات الكبيرة.

تم تحسين غشاء PVDF للكشف المناعي وهو قادر على الاحتفاظ ببروتينات مرتبطة بشكل خاص تصل إلى 160 ميكروغرام / سم 2 بمستوى منخفض جدًا من الارتباط غير المحدد.

مناعي

من الخصائص المهمة لهذا الغشاء إمكانية استخدامه المتكرر. تعمل أغشية النايلون Zeta-Probe على ربط بروتينات SDS بشكل فعال في حالة عدم وجود الكحول ، وهذا الارتباط مقاوم للعلاجات اللاحقة. كما يتم الاحتفاظ بالبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي بشكل فعال. مع قدرة ربط عالية تبلغ حوالي 480 ميكروغرام من البروتين لكل 1 سم 2 ، تسمح أغشية Zeta-Probe باكتشاف كميات ضئيلة من البروتين في مخاليط الفحص.

بعد تثبيت المستضد على الغشاء ، يتم حظر مواقع الارتباط المتبقية بمحلول الجيلاتين ، أو ألبومين مصل الأبقار ، أو الحليب الخالي من الدسم.

ثم يتم تحضين الغشاء في محلول من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أو وحيدة النسيلة لمولد الضد الذي تم اختباره. بعد غسل الأجسام المضادة غير المقيدة ، يتم تحضين الغشاء في محلول من الأجسام المضادة الثانوية ، وهي عبارة عن اتحاد من إنزيمات الفوسفاتاز القلوية (الفوسفاتاز القلوي ، AP) أو بيروكسيداز الفجل (HRP) مع الأجسام المضادة للأنواع (الأجسام المضادة للماعز للأرانب أو الفأر أو الغلوبولين المناعي البشري) أو البروتينات A (Staphylococcus aureus protein) أو G (Streptococcus sp. protein) التي لها انجذاب كبير لمنطقة Fc من الغلوبولين المناعي.

يتم الكشف عن المجمعات المناعية المتكونة بطريقة كيميائية أو كيميائية. ركائز ل تفاعل كيميائيعند استخدام اتحادات الفوسفاتيز القلوية ، استخدم 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP) أو تترازوليوم أزرق (NBT) ، وعند استخدام اقتران بيروكسيداز الفجل ، استخدم 4-كلورو -1-نافثول وبيروكسيد الهيدروجين.

نتيجة للتفاعلات الأنزيمية ، يتم تشكيل شريط ملون أو بقعة على الغشاء في موقع توطين معقد الأجسام المضادة للمستضد.

تبلغ حساسية هذه الطريقة 100 بيكوغرام من البروتين عند استخدام اقتران AP و 100-500 بيكوغرام عند استخدام اقترانات HRP. يمكن للكشف عن اللمعان الكيميائي للمجمعات المناعية أن يكتشف أقل من 5 بيكوغرام من المستضد. مبدأ هذه الطريقة هو أنه عندما يتفاعل HRP مع بيروكسيد الهيدروجين و diacylhydrazineluminol الدوري ، ينبعث الضوء بطول موجة 428 نانومتر ، والذي يمكن تسجيله على فيلم حساس للضوء.

تم تطوير تفاعل التجلط المناعي (RI) على أساس ELISA. إنها الطريقة الأكثر تحديدًا وحساسية للتحليل الكيميائي المناعي. يجمع التجلط المناعي (من اللطخة الإنجليزية - للحصول على الرطب والبقع) بين ELISA والرحلان الكهربي. يتم استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة غير المعقدة لفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن لاكتشاف الأجسام المضادة لبروتيناته الهيكلية الفردية (البروتينات- p24 ، البروتينات السكرية- gp120 ، gp 41 ، إلخ). الرجوع إلى ردود فعل الخبراء (التأكيدي) لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

يتم إجراء التفاعل على عدة مراحل:

يتم تدمير الفيروس إلى مكونات - مستضدات (p24 ، gp120 ، gp 41 ، وما إلى ذلك) ، والتي تخضع لرحلان كهربائي في هلام بولي أكريلاميد ، أي فصل المستضدات إلى كسور بالوزن الجزيئي.

2. يتم تغطية الجل بغشاء نيتروسليلوز ويتم نقل أجزاء المستضد إليه عن طريق الرحلان الكهربي. يتصرف النيتروسليلوز مثل الورق النشاف. يتم قطع الغشاء إلى شرائح (شرائح). تنتج الشركات مثل هذه الشرائط مع "بقع" من المستضدات.

التجلط المناعي - طريقة إضافية غير مباشرة

يتم غمر الشرائط التي تحتوي على مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المطبقة عليها في مصل الجسم ثم يتم غسلها من مادة غير مرتبطة.

4. يتم تحضين الشرائط بمصل مضاد للجلوبيولين المسمى بالبيروكسيديز ويتم غسلها.

تتم إضافة الركيزة ويلاحظ عدد الكسور الملونة (البقع) ، والتي تتوافق مع منطقة التوطين لمجمع AG-AT.

إن وجود خطوط في مناطق معينة من الشريط يؤكد وجود الأجسام المضادة في المصل المدروس لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة. تعتبر نتيجة التجلط المناعي إيجابية إذا كانت النطاقات المقابلة لأي اثنين من مستضدات فيروس العوز المناعي البشري الثلاثة - p24 و gp41 و gp 120 مرئية على الغشاء (الشكل 37).

الرسومات

قائمة الأدبيات المستخدمة

الأدب الرئيسي

علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات والمناعة: كتاب مدرسي لطلاب الطب. الجامعات 2nd ed. ، مصححة. وإضافية - 702 ص. إد. أ. فوروبيوف. م: MIA ، 2012.

2. علم الأحياء الدقيقة وعلم الفيروسات وعلم المناعة: دليل للدراسات المختبرية: دليل الدراسة / (V.B. Sboychakov وآخرون) ؛ إد. V.B.Sboychakova ، M.M. كاراباتس. - م: GEOTAR-Media، 2014. - 320 صفحة: مريض.

3. الأحياء الدقيقة الطبية والمناعة وعلم الفيروسات [مورد إلكتروني]: كتاب مدرسي للعسل.

الجامعات - 760 ص. - وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I.، Babichev S.A. سانت بطرسبرغ: سبيتسليت ، 2010.

4. علم الأحياء الدقيقة الطبية ، وعلم الفيروسات والمناعة [مورد إلكتروني]: كتاب مدرسي: في مجلدين / V. 1. - 448 ص. - وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V.، Boychenko M.N.

م: جيوتار ميديا ، 2010..

5. الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات والمناعة [المصدر الإلكتروني]: كتاب مدرسي: في مجلدين ، المجلد 2. - 480 ص. وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V.، Boychenko M.N. م: جيوتار ميديا ، 2010.

أدب إضافي

1. ردود الفعل المناعية: الدورة التعليمية/ جمعه: G.K. Davletshina ، Z.G. Gabidullin ، A.A. Akhtariyeva ، M.M.

Khusnarizanova ، Yu.Z. Gabidullin ، M.M. Alsynbaev - Ufa: دار النشر لـ GBOU VPO BSMU التابع لوزارة الصحة الروسية ، 2016. - 86p.

2. ميزات بعض الخصائص التي تحدد القدرة المسببة للأمراض من أشكال متنوعة المزروعة بشكل مشترك من Enterobacter ، Сitrobacter ، Serratia ، E. coli ، بكتيريا Proteus: منشور علمي / Yu. Z. Gabidullin ، R. S. Sufiyarov ، I. I. Dolgushin - Ufa ، 2015. - 250 ثانية.

الصفحة الرئيسية »اللطخة المناعية - ما هو؟ لطخة مناعية في التشخيص أمراض معدية

اللطخة المناعية - ما هذا؟ اللطخة المناعية في تشخيص الأمراض المعدية

ما هي الطعمه المناعيه؟ هذه طريقة تشخيص معملية شائعة. اصابات فيروسيةشخص. إنها واحدة من أكثر الطرق دقة وموثوقية للكشف عن وجود فيروس نقص المناعة البشرية.

من أجل الموثوقية ، فهي أكبر من مقايسة الممتز المناعي المقترن بالإنزيم (إليسا). تعتبر نتائج اللطخة المناعية حاسمة وقاطعة

اللطخة المناعية - ما هذا؟ من أجل التعرف على شخص مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية ، يجب أن تخضع لفحص معملي لاختبار وجود الأجسام المضادة في مصل الدم.

تسمى طريقة مقاطع اللطخة الغربية أيضًا باللطخة الغربية (اللطخة الغربية). يتم استخدامه للكشف عن الالتهابات الفيروسية البشرية ، كطريقة خبراء إضافية. هذا ضروري لتأكيد ELISA - اختبار معمل يسمح لك بتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في الدم. إعادة فحص الطعمة المناعية ELISA إيجابية.

يعتبر الأكثر حساسية وتعقيدًا وتكلفة.

استهداف

ما هي الطعمه المناعيه؟ هذه الطريقة من الاختبارات المعملية لمصل الدم لوجود الأجسام المضادة للفيروس.

خلال الدراسات الخاصة للبروتينات الفيروسية الكلية في الهلام وعلى أغشية النيتروسليلوز.

التجلط المناعي (الكشف عن الأجسام المضادة في مصل المرضى لبعض مستضدات مسببات الأمراض)

يهدف إجراء قسم اللطخة الغربية إلى تحديد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مراحل مختلفة. في الخطوة الأولى ، يخضع الفيروس المنقى من أجزائه المكونة للرحلان الكهربائي والمضادات الموجودة فيه مقسومة على الوزن الجزيئي.

يتكاثر فيروس نقص المناعة البشرية في الخلايا الحية المضمنة في معلوماته الوراثية. في هذه المرحلة ، يصبح الشخص حاملاً لفيروس نقص المناعة البشرية إذا كنت مصابًا.

خصوصية هذا المرض هو أنه لفترة طويلةلا تظهر. يدمر الفيروس الخلايا الليمفاوية ، وبالتالي تقل مناعة الشخص ويصبح الجسم غير قادر على محاربة العدوى.

إذا تم علاج فيروس نقص المناعة البشرية بشكل صحيح وفي الوقت المناسب ، فسيعيش المريض في سن الشيخوخة. نقص العلاج يؤدي حتمًا إلى الموت. من لحظة الإصابة ، ولكن بدون علاج ، لا تزيد المدة القصوى عن عشر سنوات.

الخصائص

يعد تحليل اللطخة المناعية طريقة موثوقة تسمح لك بتحديد وجود أجسام مضادة لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية من النوع الأول والثاني.

إذا أصيب الشخص بعد أسبوعين من الأجسام المضادة ، والتي يمكن اكتشافها في وقت لاحق. من سمات فيروس نقص المناعة البشرية أن كمية الأجسام المضادة تزداد بسرعة وتبقى في دم المريض. حتى في حالة وجودها ، فقد لا يظهر المرض لمدة عامين أو أكثر. لا تشير طريقة ELISA دائمًا بدقة إلى وجود المرض ، مما يتطلب تأكيد النتائج من مقاطع PCR و Western blot إذا أظهر الإنزيم المناعي نتيجة إيجابية.

مؤشرات ل

ما هو نوع "الطعم المناعي" الذي تم اكتشافه بالفعل ، ولكن أي نوع تم تقديمه في الدراسة؟

سيكون سبب اختبار الجلطة المناعية لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) نتيجة ELISA إيجابية. من الضروري الخضوع لفحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم في المرضى الذين هم على وشك الخضوع لعملية جراحية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب عليك إجراء تحليل للنساء اللواتي يخططن للحمل ، وكذلك النساء غير الشرعيين. يتم إعطاء مقاطع لطخة غربية للمرضى المصابين بعدوى فيروس العوز المناعي البشري إذا كانت نتائج إليسا مشكوك فيها.

قد تكون الأعراض المزعجة التالية سببًا لاستشارة الطبيب: فقدان الوزن السريع ؛ ضعف وفقدان الوظيفة ؛ اضطراب الأمعاء (الإسهال) الذي يستمر ثلاثة أسابيع ؛ الجفاف ؛ الحمى ؛ زيادة الغدد الليمفاويةفي الجسم ؛ تطور داء المبيضات والسل والالتهاب الرئوي وداء المقوسات وتفاقم الهربس.

لا يحتاج المريض للتحضير قبل تناوله الدم الوريدي.

لا تأكل لمدة 8-10 ساعات قبل الاختبار. لا ينصح بشرب المشروبات الكحولية والقهوة ، والتمارين البدنية الثقيلة ، لتجربة الإثارة في اليوم السابق للتبرع بالدم.

أين يتم التحليل؟

أين يمكنني إجراء اختبار فيروس نقص المناعة البشرية؟

يعطي تحليل ELISA ، وهو تحليل للطبقة المناعية يتم إجراؤه في العيادات الحضرية الخاصة ، النتائج في غضون يوم واحد. التشخيص الفوري ممكن أيضًا. في المؤسسات العامة ، تكون فحوصات إليسا الطبية وأقسام اللطخة الغربية مجانية ، وفقًا لتشريعات الاتحاد الروسي.

الفحص الإجباري للأمراض المعدية للحوامل والمرضى الذين يحتاجون إلى الاستشفاء أو الجراحة كيف يتم إجراء هذه الدراسة؟

كيفية إجراء ELISA؟ الطعمه المناعيه ايجابيه / سلبيه تؤكد أو تدحض نتائج إليسا. العميلة جد بسيطة. يأخذ الأخصائي الدم الوريدي ، وفي الوقت المناسب يستغرق أقل من خمس دقائق.

بعد أخذ العينات ، يجب تطهير موقع الحقن وختمه بالجص. يتم أخذ العينات على معدة فارغة ، لذلك بعد العملية لا يضر تناول قطعة من الشوكولاتة الداكنة أو مشروب ساخن حلو.

للحصول على إحالة لإجراء تحليل مجاني في مؤسسة طبية عامة ، يجب عليك زيارة معالج.

بشكل عام ، لا تختلف اللطخة المناعية عن اختبارات الدم الأخرى عن طريق أخذ العينات. منهجية البحث بسيطة. إذا كان الفيروس موجودًا في دم الشخص ، يبدأ الجسم في إنتاج أجسام مضادة لتدميره. يوجد العديد من مستضدات البروتين لكل فيروس. الكشف عن هذه الأجسام المضادة هو أساس طريقة التقسيم لطخة ويسترن. سعر

كم تحليل؟ يشير فيروس نقص المناعة البشرية المناعي إلى الأبحاث الرخيصة.

في المتوسط ، تتراوح طرق الفحص المناعي من 500 إلى 900 روبل. أقسام اللطخة الغربية عبارة عن فحص دراسي ، تتراوح تكلفته من ثلاثة إلى خمسة آلاف روبل. الأساليب الأكثر تعقيدًا أغلى بكثير. على سبيل المثال ، لتحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، ستحتاج إلى دفع حوالي 12000 روبل.

تفسير النتائج

أكثر الطرق شيوعًا لتشخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري هي المقايسة المناعية الإنزيمية والطفحة المناعية.

هم لتحديد الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في المصل. عادة ما يتم تأكيد العدوى باختبارين: الفحص والتأكيد. يجب أن يتم تفسير النتائج من قبل الطبيب ، فهو يشخص ويصف العلاج. إذا كانت اللطخة المناعية موجبة ، فهذا يعني ذلك جسم الانسانفايروس.

لا ينبغي أن تكون النتيجة الإيجابية سببًا للعلاج الذاتي ، حيث قد يكون لكل مريض صورته الخاصة عن المرض.

يشمل التحليل النوعي الفحص وإصدار الشهادات. إذا لم يكن المريض مصابًا بالفيروس تكون النتيجة "سلبية". عندما يتم العثور على هذه الشهادة ، يتم إجراء اختبارات فحص إضافية. تحليل اللطخة المناعية الذي يؤكد أو يدحض الفحص. إذا ظهرت شرائط الاختبار في ظلمة مناطق معينة (توطين البروتين) ، فإن التشخيص هو "فيروس نقص المناعة البشرية".

إذا كانت النتائج مشكوك فيها ، يتم إجراء الاختبارات في غضون ثلاثة أشهر.

لمنع الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، من الممكن إذا اتبعت قواعد معينة: تجنب الاتصال الجنسي العرضي ، واستخدام الواقي الذكري أثناء الاتصال ، وعدم استخدام الأدوية.

إذا تم الكشف عن المرض لدى المرأة الحامل ، فمن المهم اتباع توصيات الطبيب المعالج ، ولا تنسى إجراء فحوصات لوجود الفيروس.

ما هو النشاف الغربي؟

يعد تحديد البروتين في الخلائط المعقدة أو المستخلصات من الأنسجة المختلفة أحد المشكلات التي يتم مواجهتها بشكل متكرر. باستخدام مثل هذه الأداة كأجسام مضادة محددة ، من الممكن تحديد البروتين قيد الدراسة بحد أدنى من الوقت والتكاليف المالية.

في طريقة النشاف الغربية ، في المرحلة الأولى ، يتم فصل خليط من البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، ثم يتم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق التكتل الكهربائي.

يكمن جوهر هذه الطريقة في حقيقة أن الهلام بعد الرحلان الكهربائي يوضع على غشاء النيتروسليلوز بين طبقات ورق الترشيح. يتم وضع "الشطيرة" التي يتم تجميعها بهذه الطريقة في مجال كهربائي بحيث تتحرك مجمعات البروتين SDS عبر لوحة الهلام ويتم تثبيتها (نتيجة الامتصاص غير المحدد) على سطح غشاء النيتروسليلوز.

في ارتباط مركب البروتين-SDS بغشاء النيتروسليلوز ، تشارك القوى الكهربائية بشكل أساسي ، وهذا التفاعل متعدد النقاط ويؤدي إلى "انتشار" البروتينات على سطح الغشاء. وهكذا ، بعد النقل الكهربائي ، نحصل على نسخة طبق الأصل من الجل على النيتروسليلوز مع البروتينات المرتبة بنفس الطريقة كما في هلام بولي أكريلاميد.

بعد SDS - الرحلان الكهربائي ، النقل الكهربائي وامتصاص البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز ، يتغير التكوين العالي للبروتين بشكل كبير ، إذا كان من الصحيح عمومًا التحدث عن وجود بنية ثلاثية للبروتين بعد مثل هذه المعاملة القاسية . لذلك ، من أجل الكشف الكيميائي المناعي للبروتين قيد الدراسة ، عادةً ما يتم استخدام الأجسام المضادة أحادية أو متعددة النسيلة الخاصة بالمناطق الخطية لجزيء البروتين.

51. إنزيم المقايسة المناعية ، المناعية. آلية ، مكونات ، تطبيق.

لا تعد الأجسام المضادة المحددة للحلقات التوافقية (أو المواقع التي تتضمن ملامسات بين الوحدات الفرعية) مناسبة بشكل عام للاستخدام في طريقة لطخة ويسترن.

بعد نقل البروتين ، يتم تحضين الغشاء بالتسلسل بأجسام مضادة خاصة بالبروتين قيد الدراسة ، ثم بأجسام مضادة ثانوية خاصة بشظايا Fc من الأجسام المضادة الأولية ، مقترنة بملصق إنزيم (أو غيره) (الشكل.

1 أ). في حالة اقتران الأجسام المضادة الأولية الخاصة بمولد الضد المدروس مباشرةً مع الملصق ، لا تكون الأجسام المضادة الثانوية مطلوبة (الشكل 1 ب). تتجلى المجمعات المناعية المتكونة في موقع توطين البروتين المدروس بمساعدة ركيزة كروموجينية (حسب نوع الملصق).

تعتمد حساسية وخصوصية الطريقة بشكل كبير على الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة.

يجب أن تكون الأجسام المضادة المستخدمة خاصة بتسلسل فريد من الأحماض الأمينية خاص بالبروتين قيد الدراسة فقط. خلاف ذلك ، يمكن التفاعل (خاصة في حالة المستخلصات البروتينية الخشنة) للأجسام المضادة مع العديد من جزيئات البروتين ، مما يؤدي بدوره إلى ظهور عدة شرائط ملونة على الغشاء.

غالبًا ما يكون تحديد البروتين قيد الدراسة في هذه الحالة صعبًا أو مستحيلًا.

العامل الثاني المهم الذي يجب أخذه في الاعتبار عند اختيار الأجسام المضادة هو التقارب. كلما زاد تقارب الأجسام المضادة المستخدمة ، كلما كانت بقعة شرائط البروتين أكثر إشراقًا ووضوحًا ، زادت حساسية الطريقة. عند استخدام الأجسام المضادة عالية التقارب ، يمكن تحقيق حساسية 1 نانوغرام أو أعلى.

لتصور نتيجة تفاعل المستضد والأجسام المضادة المرتبطة بالغشاء ، يتم استخدام أجسام مضادة ثانوية مترافقة مع عوامل قادرة على إعطاء إشارة معينة في ظل ظروف معينة.

عادة ، يتم استخدام إنزيم (بيروكسيداز أو فوسفاتيز) كعامل ، يكون لمنتج التفاعل لون ويتراسب على الغشاء في شكل راسب غير قابل للذوبان.

من الممكن أيضًا استخدام ملصقات الفلورسنت في هذه الطريقة.

أرز. 1. مخطط التلوين الكيميائي المناعي للبروتين المدروس: أ - استخدام أجسام مضادة ثانوية مترافقة مع ملصق إنزيم. ب - يتم اقتران الجسم المضاد الأساسي مباشرة بعلامة إنزيم.

بروتوكول:

I. إعداد الجل والغشاء ونقل البروتين الكهربائي

تم وضع جل بولي أكريلاميد بعد الرحلان الكهربائي في حمام مع محلول نشاف (25 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.3 ، 192 ملي جلايسين ، 10٪ إيثانول).

يتم وضع ورقتين من ورق الترشيح ، مقطوعين على شكل شريط التنشيف ومبللين بمخزن نشاف ، على جزء من الكاسيت الذي سيواجه الأنود. بعد ذلك ، يتم وضع غشاء النيتروسليلوز المبلل مسبقًا بنفس المخزن المؤقت على ورق الترشيح ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين الغشاء والورق.

بعد ذلك ، يجب وضع الجل بعناية على الغشاء ، مع إيلاء اهتمام خاص مرة أخرى لعدم وجود فقاعات هواء بين الجل والغشاء. يتم استكمال الساندويتش بطبقتين من ورق الترشيح المبلل ، والتي توضع على سطح الهلام (الشكل 2). يتم تثبيت الشطيرة الناتجة في الكاسيت وتوضع بين الأقطاب الكهربائية بحيث يواجه الغشاء الأنود.

أرز. 2. مخطط النقل الكهربائي للبروتينات إلى الغشاء.

II. كهربي

يتم إجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز في مخزن مؤقت يحتوي على 25 ملي مولار من Tris ، ودرجة الحموضة 8.3 ، و 192 ملي جلايسين ، و 10٪ إيثانول لمدة 30-50 دقيقة بجهد ثابت 100 فولت.

يعتمد وقت النقل الكهربائي على حجم البروتينات المنقولة ، فكلما زاد حجم البروتين ، كلما استغرق النقل الكهربائي وقتًا أطول. يتم تقييم جودة النقل الكهربائي وترتيب عصابات البروتين عن طريق تلطيخ غشاء النيتروسليلوز بمحلول 0.3٪ من Ponceau S في 1٪. حمض الاسيتيك. قبل التلوين المناعي ، يجب غسل الغشاء عدة مرات بمحلول تريس مائي قلوي قليلًا لإزالة الصبغة المرتبطة بالبروتين.

ثالثا. تلطيخ كيميائي مناعي للبروتينات المعطلة على غشاء النيتروسليلوز

لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة ، يتم تحضين الغشاء مع التقليب المستمر عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في PBST (للحصول على حجب أفضل ، يمكن استخدام محلول PBST يحتوي على 10٪ من مسحوق الحليب منزوع الدسم).

بعد الانسداد ، يحضن الغشاء لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب المستمر في PBST الذي يحتوي على 1-10 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة المحددة.

يتم اختيار التركيز الأمثل للأجسام المضادة بشكل تجريبي ويعتمد على ألفة تفاعل الأجسام المضادة مع المستضد.

في نهاية الحضانة ، تم غسل الغشاء 5 مرات باستخدام PBST ونقله إلى محلول من الأجسام المضادة الثانوية المترافق مع بيروكسيداز الفجل. عادة ما يتم توضيح تخفيف الاتحاد من قبل الشركة المصنعة على العبوة ، أو يتم اختياره تجريبياً من قبل الباحث. احتضان الغشاء في محلول من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة مع التحريك المستمر.

بعد الغسيل الشامل (على الأقل 5-6 تغييرات في المخزن المؤقت) ، يتم نقل غشاء PBST إلى محلول ركيزة كروموجينيك يحتوي على 3 ملغ ديامينوبنزيدين (DAB) و 10 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين في 10 مل من 0.1 M Tris-HCl ، pH 7.6 .

تتم الحضانة مع التحريك لمدة 5 إلى 10 دقائق. بعد انتهاء فترة الحضانة مع الركيزة ، يجب غسل الغشاء بـ PBST ، وتجفيفه عن طريق النشاف بورق الترشيح ، وعمل نسخة إلكترونية على الفور عن طريق المسح الضوئي بالألوان. إذا جف الغشاء تمامًا ، تتلاشى خطوط البروتين المصبوغة ، وتكون الصورة أقل سطوعًا وتباينًا.

ملحوظة: مادة ثنائي الفينيل متعدد الكلور مادة سامة ومن المحتمل أن تكون مسرطنة. تعمل فقط مع القفازات المطاطية!

وفقًا لتوصية منظمة الصحة العالمية ، يتم استخدام التخمير المناعي (لطخة غربية) في تشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كطريقة خبيرة إضافية ، والتي يجب أن تؤكد نتائج ELISA. تُستخدم هذه الطريقة عادةً للتحقق مرة أخرى من نتيجة ELISA الإيجابية ، حيث تعتبر أكثر حساسية وتحديدًا ، على الرغم من أنها أكثر تعقيدًا وتكلفة.

يجمع التجلط المناعي بين المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA) والفصل الكهربي الأولي لبروتينات الفيروس في مادة هلامية ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز. يتكون الإجراء المناعي من عدة خطوات (الشكل 27). أولاً ، يتم تنقية فيروس نقص المناعة البشرية مسبقًا وتدمير مكوناته المكونة له ، ويتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية للرحلان الكهربائي ، بينما يتم فصل جميع المستضدات التي يتكون منها الفيروس عن طريق الوزن الجزيئي. ثم ، عن طريق النشاف ، يتم نقل المستضدات من الجل إلى شريط من النيتروسليلوز أو مرشح نايلون ، والذي يحتوي الآن على طيف من البروتينات المميزة لفيروس نقص المناعة البشرية ، غير المرئية للعين. بعد ذلك ، يتم تطبيق مادة الاختبار (مصل ، بلازما المريض ، إلخ) على الشريط ، وإذا كانت هناك أجسام مضادة محددة في العينة ، فإنها ترتبط بشرائط بروتينات المستضد التي تتوافق معها بدقة. نتيجة للتلاعب اللاحق (مثل ELISA) ، يتم تصور نتيجة هذا التفاعل - وجعلها مرئية. إن وجود خطوط في مناطق معينة من الشريط يؤكد وجود الأجسام المضادة في المصل المدروس لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة.

في روسيا ، في الوقت الحاضر ، الإجراء القياسي للتشخيص المختبري لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية هو الكشف عن الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشريةباستخدام المقايسة المناعية الإنزيميةمتبوعًا بتأكيد خصوصيتها في التفاعل النشاف المناعي.

تظهر الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في 90-95٪ من المصابين في غضون 3 أشهر بعد الإصابة ، وفي 5-9٪ - بعد 6 أشهر من لحظة الإصابة ، وفي 0.5-1٪ - في وقت لاحق. أقرب وقت للكشف عن الأجسام المضادة هو أسبوعين من لحظة الإصابة.

يتضمن اكتشاف الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية مرحلتين. في المرحلة الأولىيتم الكشف عن الطيف الكلي للأجسام المضادة ضد مستضدات فيروس العوز المناعي البشري باستخدام اختبارات مختلفة: المقايسة المناعية الإنزيمية ، التراص ، المركب ، المشط ، مرشح الغشاء أو الغشاء المنتشر. في المرحلة الثانيةيستخدم التجلط المناعي لتحديد الأجسام المضادة للبروتينات الفردية للفيروس. في العمل ، يُسمح باستخدام أنظمة الاختبار التي لديها إذن للاستخدام من قبل وزارة الصحة في الاتحاد الروسي. يجب تنفيذ إجراءات التشخيص فقط وفقًا للتعليمات المعتمدة لاستخدام الاختبارات المناسبة.

أخذ عينات الدم من الوريد المرفقي إلى أنبوب اختبار نظيف وجاف بكمية 3-5 مل. يمكن أخذ دم الحبل السري من الأطفال حديثي الولادة. لا يُنصح بتخزين المواد التي تم الحصول عليها (الدم الكامل) لأكثر من 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة ولمدة تزيد عن يوم واحد في الثلاجة عند 4-8 درجات مئوية. قد يؤثر انحلال الدم القادم على نتائج التحليل. يتم فصل المصل عن طريق الطرد المركزي أو عن طريق تتبع الدم على طول جدار أنبوب الاختبار باستخدام ماصة باستور أو قضيب زجاجي. يُنقل المصل المنفصل إلى أنبوب اختبار نظيف (ويفضل أن يكون معقمًا) أو قنينة أو حاوية بلاستيكية ، ويمكن تخزينه في هذا الشكل لمدة تصل إلى 7 أيام عند درجة حرارة 4-8 درجات مئوية. أثناء العمل ، يجب اتباع قواعد السلامة الواردة في "تعليمات نظام مكافحة الأوبئة في مختبرات تشخيص الإيدز" رقم 42-28 / 38-90 بتاريخ 5 يوليو 1990.

تحديد مجموع الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.

عند استلام أول نتيجة إيجابية ، يتم إجراء التحليل مرتين أخريين (باستخدام نفس المصل وفي نفس نظام الاختبار). إذا تم الحصول على نتيجة إيجابية واحدة على الأقل (نتيجتان إيجابيتان من ثلاثة اختبارات ELISA) ، يتم إرسال المصل إلى المختبر المرجعي.

في المختبر المرجعي ، يتم إعادة فحص الأمصال الإيجابية الأولية (أي تلك التي أعطت نتيجتين إيجابيتين في نظام الاختبار الأول) في ELISA في نظام الاختبار الثاني (الآخر) الذي تم اختياره للتأكيد.

عند الحصول على نتيجة إيجابية للتحليل في نظام الاختبار الثاني ، يجب فحص المصل في IS.

إذا تم الحصول على نتيجة سلبية في نظام الاختبار الثاني ، يعاد فحص المصل في نظام الاختبار الثالث.

إذا تم الحصول على نتيجة اختبار سلبية في نظامي الاختبار الثاني والثالث ، يتم إصدار استنتاج بشأن عدم وجود أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.

عندما يتم الحصول على نتيجة إيجابية في نظام الاختبار الثالث ، يتم إرسال المصل أيضًا للتحليل في النشاف المناعي.

النشاف المناعي.

مبدأ الطريقة هو الكشف عن الأجسام المضادة لبعض بروتينات الفيروس المعطلة على غشاء النيتروسليلوز. يشار عادةً إلى بروتينات الغلاف (env) لـ HIV-1 بالبروتينات السكرية ("gp" أو "gp") ، مع الأوزان الجزيئية المعبر عنها بالكيلو دالتون (cd): 160 كيلو دالتون ، 120 كيلو دالتون ، 41 كيلو دالتون. يبلغ وزن البروتينات السكرية HIV-2 140 كيلو دالتون ، 105 ك د ، 36 ك د. البروتينات الأساسية (gag) (يشار إليها عادةً بالبروتينات - "p" أو "r") في HIV-1 لها وزن جزيئي قدره 55 كيلو دالتون ، 24 كيلو دالتون ، 17 كيلو دالتون ، على التوالي ، و HIV-2-56 كيلو دالتون ، 26 كيلو د. 18 د. إنزيمات HIV-1 (pol) لها وزن جزيئي قدره 66 كيلو دالتون ، 51 ك د ، 31 ك د ، HIV-2-68 ك د.

يتم تفسير نتائج التجلط المناعي على أنها إيجابية وغير محددة وسلبية.

إيجابي(إيجابية) تعتبر عينات يتم فيها اكتشاف الأجسام المضادة لـ 2 أو 3 بروتينات سكرية لفيروس نقص المناعة البشرية.

نفي(سلبي) هي الأمصال التي لا تكتشف الأجسام المضادة لأي من المستضدات (البروتينات) لفيروس نقص المناعة البشرية.

تعتبر العينات التي تكشف عن الأجسام المضادة لبروتين سكري واحد لفيروس نقص المناعة البشرية و / أو أي من بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية متردد(غير محدد أو غير قابل للتفسير).

عندما يتم الحصول على نتيجة غير محددة بالأجسام المضادة للبروتينات الأساسية (الكمامة) في لطخة المناعة مع مستضدات HIV-1 ، يتم إجراء اختبار مع مستضدات HIV-2.

عند تلقي نتائج إيجابية من النشاف المناعي ، يتم التوصل إلى استنتاج حول وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في مادة الاختبار.

عند تلقي نتيجة اختبار سلبية ، يصدر البكالوريا الدولية استنتاجًا مفاده أنه لا توجد أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.

عند تلقي نتيجة غير محددة (إذا لم يتم اكتشاف مستضد p24) ، يتم إجراء اختبارات متكررة للأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بعد 3 أشهر ،

مع الحفاظ على نتائج غير محددة بعد 3 أشهر أخرى. إذا تم اكتشاف مستضد p24 ، يتم إجراء فحص ثانٍ بعد أسبوعين من تلقي أول نتيجة غير محددة.

إذا تم الحصول على نتائج غير محددة مرة أخرى بعد 6 أشهر من الفحص الأول ، ولم يكن لدى المريض عوامل خطر للعدوى والأعراض السريرية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، فإن النتيجة تعتبر إيجابية كاذبة. (في حالة وجود مؤشرات وبائية وسريرية ، يتم تكرار الدراسات المصلية حسب ما هو مقرر).

النشاف المناعي باستخدام عديد ببتيدات خاصة بالفيروسات "لطخة HIV" يختلف من حيث أنه لا يستخدم البروتينات الفيروسية نفسها ، ولكن عديد الببتيدات المؤتلفة - نظائر مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية ("Env1" ، "Gag1" ، "Poll" ، "Env2"). يكتشف متعدد البيبتيد Env1 المؤتلف الأجسام المضادة مباشرة لـ HIV-1 gp120 و gp41 ، وبولي ببتيد Gag1 إلى مستضدات p17 و p24 ، وبولي ببتيد Po11 إلى مستضد p51 ، وبولي ببتيد Env2 لمستضدات HIV-2 gp110 و gp38. يعتبر المصل إيجابيًا إذا كان يتفاعل مع Env1 أو Env2 أو كليهما Env (عدوى HIV من النوع 1 و 2 من النوعين). يعتبر التفاعل مع Poll and Gag فقط نتيجة غير محددة ، وفي هذه الحالة يتم إجراء المتابعة بشكل مشابه لحالات النتائج غير المحددة لطخة مناعية كلاسيكية باستخدام محلول فيروس نقص المناعة البشرية.

خصائص التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري لدى الأطفال المولودين من أمهات مصابات بفيروس نقص المناعة البشرية هي أن الأطفال المصابين وغير المصابين في الأشهر 6-12 الأولى من العمر لديهم أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية من الأم ، والتي يمكن أن تختفي بعد ذلك. المعيار الذي يشير إلى وجود إصابة بفيروس نقص المناعة البشرية لدى الطفل هو اكتشاف الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في سن 18 شهرًا أو أكثر. يعد عدم وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية لدى طفل يبلغ من العمر 18 شهرًا يولد لأم مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية معيارًا ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

جهاز المناعة(لطخة غربية) - طريقة الاختبار المختبري لمصل الدم لوجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية ؛ إنه اختبار أكثر دقة من ELISA ويستخدم لتأكيد نتائج ELISA. ELISA - مقايسة مناعية إنزيم (ELISA) - البحوث المخبرية، والذي يسمح بتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في الدم ؛ اختبار الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.

يجمع التجلط المناعي بين المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA) والفصل الكهربي الأولي لبروتينات الفيروس في مادة هلامية ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز. يتكون إجراء اللطخة المناعية من عدة مراحل (). أولاً ، يتم تنقية فيروس نقص المناعة البشرية مسبقًا وتدمير مكوناته المكونة له ، ويتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية للرحلان الكهربائي ، بينما يتم فصل جميع المستضدات التي يتكون منها الفيروس عن طريق الوزن الجزيئي. ثم ، عن طريق النشاف ، يتم نقل المستضدات من الجل إلى شريط من النيتروسليلوز أو مرشح نايلون ، والذي يحتوي الآن على طيف من البروتينات المميزة لفيروس نقص المناعة البشرية ، غير المرئية للعين. بعد ذلك ، يتم تطبيق مادة الاختبار (مصل ، بلازما المريض ، إلخ) على الشريط ، وإذا كانت هناك أجسام مضادة محددة في العينة ، فإنها ترتبط بشرائط بروتينات المستضد التي تتوافق معها بدقة. نتيجة للتلاعب اللاحق (مثل ELISA) ، يتم تصور نتيجة هذا التفاعل - وجعلها مرئية. إن وجود خطوط في مناطق معينة من الشريط يؤكد وجود الأجسام المضادة في المصل المدروس لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة.

يستخدم التجلط المناعي بشكل شائع لتأكيد تشخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري. تعتبر منظمة الصحة العالمية أن الأمصال إيجابية إذا تم الكشف عن الأجسام المضادة لأي اثنين من بروتينات غلاف فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق التكتل المناعي. وفقًا لهذه التوصيات ، إذا كان هناك تفاعل مع بروتين واحد فقط من بروتينات الغلاف (gp160 ، gp120 ، gp41) مع أو بدون تفاعل مع البروتينات الأخرى ، فإن النتيجة تعتبر مشكوك فيها ويوصى بإجراء دراسة ثانية باستخدام مجموعة من سلسلة مختلفة أو من شركة أخرى. إذا بقيت النتيجة بعد ذلك مشكوك فيها ، تستمر الدراسات كل 3 أشهر.

بالنسبة للتخثر المناعي ، في المرحلة الأولى ، يتم فصل البروتينات الموجودة في مصل الدم في الهلام وفقًا لوزنها الجزيئي وشحنتها باستخدام مجال كهربائي (طريقة الفصل الكهربائي للهلام). ثم يتم وضع غشاء نيتروسليلوز أو نايلون على الجل و "مبلل" (هذا نشاف). يتم ذلك في غرفة خاصة تسمح بنقل المادة بشكل كامل من الجل إلى الغشاء. نتيجة لذلك ، يتم إعادة إنتاج نمط ترتيب البروتين الموجود على الجل على الغشاء (لطخة) ، والذي يمكن بعد ذلك التلاعب به بسهولة. في البداية ، يتم معالجة الغشاء بأجسام مضادة للمستضد المطلوب ، وبعد غسل المادة غير المرتبطة ، تتم إضافة اتحاد مُصنَّف إشعاعيًا يرتبط بالأجسام المضادة (كما في ELISA). يتم تحديد موقع المركب المترافق الناتج عن الأجسام المضادة عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي باستخدام فيلم الأشعة السينية. بعد ظهوره ، يتضح كل شيء ما إذا كان هناك مستضدات في الدم أم لا.