Kaj je osnova delovanja reakcije aglutinacije. Aglutinacijska reakcija (RA), mehanizem in metode nastavitve. Sestavine in kako do njih. Uporaba RA pri diagnostiki nalezljivih bolezni. Imunska elektronska mikroskopija

Reakcija aglutinacije

Aglutinacija (lat. aglutinacija- lepljenje) - lepljenje (povezava) korpuskularnih delcev, ki vsebujejo antigen (cele celice, delci lateksa itd.), z molekulami specifičnih protiteles v prisotnosti elektrolitov, ki se konča s tvorbo kosmičev ali usedline (aglutinata), vidnih s prostim očesom. Narava usedline je odvisna od narave antigena: bičkove bakterije dajejo usedlino velikih kosmičev, flagelarne in brez kapsule - drobnozrnate, kapsularne - nitaste. Razlikovati neposredno aglutinacijo, pri kateri interakcija s specifičnimi protitelesi neposredno vključuje lastne antigene bakterijske ali katere koli druge celice, na primer eritrocitov; in posredno ali pasivno, pri kateri bakterijske celice ali eritrociti ali delci lateksa niso nosilci lastnih, ampak tujih antigenov (ali protiteles), adsorbiranih na njih, da zaznajo protitelesa (ali antigene), ki so specifična zanje. Aglutinacijska reakcija vključuje predvsem protitelesa iz razredov IgG in IgM. Poteka v dveh fazah: najprej pride do specifične interakcije aktivnega središča protiteles z determinanto antigena, ta stopnja se lahko pojavi v odsotnosti elektrolitov in je ne spremljajo vidne spremembe v reakcijskem sistemu. Druga stopnja, tvorba aglutinata, zahteva prisotnost elektrolitov, ki zmanjšajo električni naboj kompleksov antigen + protitelo in pospešijo proces njihovega lepljenja. Ta faza se konča s tvorbo aglutinata.

Aglutinacijske reakcije postavimo na steklene ali gladke kartonske plošče ali v sterilne aglutinacijske epruvete. Aglutinacijske reakcije (direktne in pasivne) na steklu se običajno uporabljajo kot pospešena metoda za odkrivanje specifičnih protiteles v serumu bolnika (na primer pri brucelozi) ali za serološko identifikacijo povzročitelja. V slednjem primeru se običajno uporabljajo dobro prečiščeni (adsorbirani) diagnostični serumi, ki vsebujejo samo monoreceptorska protitelesa ali njihov nabor za različne antigene. Nedvomna prednost reakcije aglutinacije na steklu je preprostost njene formulacije in dejstvo, da traja nekaj minut ali celo sekund, saj se obe komponenti v njej uporabljata v koncentrirani obliki. Vendar ima le kvalitativno vrednost in je manj občutljiv kot epruveta. Razširjeni test aglutinacije v epruvetah daje natančnejše rezultate, saj vam omogoča, da določite kvantitativno vsebnost protiteles v serumu (nastavite njegov titer) in po potrebi registrirate dejstvo povečanja titra protiteles, ki je diagnostična vrednost. Za vzpostavitev reakcije se v aglutinacijo vnese serum, razredčen z 0,85% raztopino NaCl na določen način, in enako količino (običajno 0,5 ml) suspenzije standardnega diagnostika (ali testne kulture), ki vsebuje 1 milijardo bakterij v 1 ml. cevi. Obračunavanje rezultatov reakcije aglutinacije se izvede predhodno po 2 urah inkubacije epruvet pri temperaturi 37 ° C in končno po 20-24 urah glede na dva znaka: prisotnost in velikost oborine ter stopnjo prozornost supernatanta. Ocenjevanje poteka po sistemu štirih križcev. Reakcijo nujno spremlja kontrola seruma in antigena. V primerih, ko se za serološko identifikacijo povzročitelja uporablja natančen aglutinacijski test v epruveti, ima diagnostično vrednost, če je reakcija ocenjena kot pozitivna, ko je diagnostični serum razredčen z vsaj polovico svojega titra.

Upoštevati je treba, da pri mešanju raztopin homolognih antigenov in protiteles ni vedno opaziti vidnih manifestacij aglutinacijske reakcije. Oborina nastane le pri določenih optimalnih razmerjih obeh reakcijskih komponent. Izven teh meja, z znatnim presežkom antigena ali protiteles, reakcije ni opaziti. Ta pojav se imenuje "prozonski fenomen". Opazimo ga tako pri reakciji aglutinacije kot pri reakciji obarjanja. Pojav prozona v imunskih reakcijah je razložen z dejstvom, da so v njih vključeni antigeni praviloma polideterminantni in molekule protitelesa IgG imajo dva aktivna centra. Pri presežku protiteles se površina vsakega delca antigena prekrije z molekulami protiteles, tako da ne ostane nobena prosta determinantna skupina, zato drugo, nevezano aktivno središče protiteles ne more interagirati z drugim antigenskim delcem in ju povezati med seboj. Tvorbo vidnega aglutinata ali precipitata zavira tudi presežek antigena, ko ni niti enega prostega aktivnega mesta protiteles, zato se kompleksi antigen + protitelo + antigen ne morejo več povečevati.

v mikrobiologiji

"Reakcija aglutinacije in njene vrste (RA)"

načrt:

1. Uvod……………………………………………………………………………………..3

2. RA na steklu……………………………………………………………………………………….4

3. PA iz epruvete………………………………………………………………………………….5

4. Uporabljena literatura……………………………………………………………………..7

1. Uvod.

Interakcija mikrobnega antigena in protiteles je strogo specifična in je v živalskem telesu usmerjena v nevtralizacijo patogena in njegovih toksinov. Interakcija antigena in protiteles in vitro pod določenimi pogoji spremljajo vidni pojavi (aglutinacija, precipitacija, imunska liza), kar omogoča uporabo reakcij AG-AT, imenovanih seroloških (iz latinščine serum-serum), za praktične namene. Biotovarne proizvajajo antigene in imunske serume (protitelesa) znane specifične smeri (diagnostične). S pomočjo takšnih serumov v seroloških reakcijah je mogoče identificirati neznan mikroorganizem ali z znanim antigenom odkriti protitelesa v telesu, ki se sintetizirajo kot odziv na vnos povzročitelja, in s tem postaviti diagnozo (serološka diagnoza) . Poleg tega lahko s serološkimi reakcijami ocenimo intenzivnost imunskega odziva po cepljenju ali preboleli nalezljivi bolezni.

Reakcije aglutinacije, kot sta posredna aglutinacija in Coombsova, temeljijo na in vitro interakciji korpuskularnih antigenov s protitelesi in sposobnosti precipitacije nastalih kompleksov. Kot korpuskularne antigene se uporabljajo bakterijske celice ali topni antigeni, ekstrahirani iz mikroorganizmov in adsorbirani na celicah nosilcev: eritrocitov, delcev lateksa itd.

Antigenske determinante korpuskularnih antigenov specifično interagirajo s homolognimi protitelesi (specifična, nevidna faza reakcije), nato pa kompleksi antigen-protitelo tvorijo velike, s prostim očesom vidne konglomerate, ki precipitirajo - aglutinirajo (nespecifična, vidna faza reakcije) . V neflageliranih oblikah mikrobov (Brucella) nastanejo zrnati aglutinanti, v bičkih (Escherichia, Salmonella) - veliki bombaž, ki se usede na dno epruvete v obliki obrnjenega dežnika in se pri stresanju zlahka zlomi. . Antigeni in protitelesa medsebojno delujejo le v prisotnosti elektrolita (v 0,8% raztopini natrijevega klorida). Na potek reakcije vplivajo koncentracija soli v elektrolitu, število mikrobnih celic v suspenziji, serumska koncentracija, pH, temperatura in drugi dejavniki.

Reakcija aglutinacije (ra).

Razlikovati specifično aglutinacijo, roj temelji na interakciji antigena z homologno protitelo , ki jih vsebuje telo živali, Krom je bil uveden ta antigen (imunoaglutinacija); nespecifične (kemične), ki izhajajo iz sprememb pH okolja, koncentracije elektrolitov; spontano, to-ruyu opazimo, ko bakterije (ki so v R-obliki) suspendiramo v slanici in pri segrevanju, kar je povezano s spremembo koloidnega stanja bakterijske celice. Antigen , ki sodeluje pri RA, imenujemo aglutinogen, protitelo imenujemo aglutinin, nastalo oborino imenujemo aglutinat. Pri nastanku aglutinata je pomembno kvantitativno razmerje antigena in protiteles (optimalni pojav). S presežkom ali pomanjkanjem protiteles A.

Aglutinacijska reakcija (RA) je ena prvih imunoloških reakcij, ki se uporablja v mikrobiološki praksi. Prvič (1895) je F. Vidal uporabil RA za diagnozo tifusne vročice. Kasneje (1897) je A. Wright uporabil isto reakcijo za diagnosticiranje bruceloze pri ljudeh. RA je našel uporabo tudi pri diagnozi puloroze piščancev, leptospiroze, infekcijskega splava kobil, pa tudi za tipizacijo neznanih kultur mikrobov po znanem aglutinacijskem serumu. RA je zelo občutljiv; lahko zazna 0,01 µg protitelesnega proteinskega dušika v 1 ml.

Razvitih je bilo več variant aglutinacijske reakcije, ki se razlikujejo po metodološki izvedbi in namenu študije.

2. Ra na steklu.

Pri tej različici RA lahko testiramo tako serum kot antigen, vendar se ta različica najpogosteje uporablja za identifikacijo mikroorganizmov.

1. Za identifikacijo mikroorganizma (m / o) se na razmaščeno stekleno stekelce ločeno nanese kapljica znanega aglutinacijskega seruma, kot je salmonelioza, in kapljica fiziološke raztopine (kontrola). Nato z bakteriološko zanko vzamemo bakterijsko maso proučevane kulture iz kolonije v petrijevki ali s površine poševne MPA v epruveti in jo ločeno suspendiramo v imunskem serumu in fiziološki raztopini, dokler ne dobimo homogene suspenzije. . Rezultat se upošteva po 2 ... 4 minutah.

Upoštevanje rezultatov: v kontrolnem vzorcu ne sme biti sprememb. S posebnim ujemanjem bakterijske kulture z imunskim serumom se pojavijo kosmiči aglutinata (pozitiven rezultat), v odsotnosti pojava aglutinacije se sklepa, da proučevana bakterijska kultura ne ustreza imunskemu serumu.

2. Odkrivanje protiteles v proučevanem krvnem serumu bomo obravnavali na primeru testa rose-bengal, ki se uporablja pri serodiagnostiki bruceloze. Na predmetno stekelce nanesemo 0,3 ml krvnega seruma proučevane živali in 0,03 ml antigena brucele (celice brucele, obarvane z rožnato bengalko). Komponente se temeljito premešajo s stresanjem kozarca in rezultat se upošteva po 4 minutah.

Računovodski rezultati: s pozitivno reakcijo se pojavijo rožnati kosmiči aglutinata. Serološka reakcija te vrste je razvrščena kot kvalitativna, saj jo je mogoče uporabiti za odkrivanje protiteles proti patogenu v krvnem serumu živali, vendar je nemogoče oceniti njihovo kvantitativno vsebnost.

Reakcija aglutinacije (RA) je adhezija in obarjanje mikrobov ali drugih celic pod delovanjem protiteles v prisotnosti elektrolita. Nastalo oborino imenujemo aglutinat.

RA se uporablja:

1. Za odkrivanje protiteles v bolnikovem krvnem serumu (serodiagnostika).

2. Določiti vrsto in serovar čiste kulture patogenih mikroorganizmov, izolirane od bolnika (serotipizacija).

Aglutinacijska reakcija se uporablja za določanje protiteles v krvnem serumu bolnikov, na primer s tifusom in paratifusom (Vidalova reakcija), brucelozo (Wrightova, Huddlesonova reakcija), tularemijo, leptospirozo in drugimi nalezljivimi boleznimi, pa tudi za določanje povzročitelja, izoliranega od bolnika (črevesne okužbe, oslovski kašelj itd.). RA se uporablja za določanje krvnih skupin, Rh faktorja itd.

Reakcija zahteva naslednje komponente:

1. Antigen (aglutinogen) mora biti korpuskularen, to je suspenzija živih ali mrtvih mikroorganizmov (diagnoza m), eritrocitov ali drugih celic. Običajno se uporablja dnevna kultura mikroorganizmov, vzgojenih na poševnem agarju. Kulturo speremo s 3-4 ml izotonične raztopine, prenesemo v sterilno epruveto in določimo gostoto. Suspenzija mora biti homogena in vsebovati do 3 milijarde mikrobnih celic na 1 ml. Delo olajša uporaba suspenzije ubitih mikrobov - diagnostikumov (pripravljeno v tovarni).

2. Protitelesa (aglutinine) najdemo v bolnikovem serumu (s serodiagnozo) ali v aglutinacijskem serumu (s serotipizacijo). Aglutinacijske serume dobimo z imunizacijo kuncev z mrtvimi bakterijami.

Titer aglutinira serum se imenuje njegova najvišja razredčitev, v kateri pod določenimi eksperimentalnimi pogoji ne reagira z ustreznim antigenom.

Aglutinacijski serumi so lahko nativni (neadsorbirani) in adsorbirani. Nativni serumi v majhnih razredčinah ne vplivajo samo na vrsto mikroorganizmov, s katerimi je bila žival imunizirana za pridobitev seruma, temveč tudi na sorodne vrste mikroorganizmov, saj vsebujejo skupinska protitelesa (protitelesa proti mikroorganizmom, ki imajo skupne antigene). Nativni serumi se uporabljajo za razširjeno aglutinacijsko reakcijo (s serodiagnozo), ki ne upošteva le prisotnosti reakcije, temveč tudi dinamiko povečanja titra protiteles.

Če skupinska protitelesa ekstrahiramo (adsorbiramo) iz naravnega seruma z interakcijo s sorodnimi bakterijami, ki imajo skupinske antigene, dobimo adsorbirane serume. Adsorbirani serumi so lahko monoreceptorski (ali tipsko specifični), ki vsebujejo protitelesa samo proti enemu antigenskemu receptorju.Polivalentni serumi so sestavljeni iz mešanice več adsorbiranih ali neadsorbiranih serumov. Za reakcijo aglutinacije na steklu se uporabljajo adsorbirani serumi.

Ko so živali imunizirane z gibljivimi bakterijami s H-antigenom, dobimo H-aglutinacijske serume, ki vsebujejo H-protitelesa (na primer Salmonella monoreceptor H-aglutinacijski serum). Imunizacija z O-antigenom povzroči O-aglutinacijske serume, ki vsebujejo O-protitelesa (na primer O-aglutinacijski serum, adsorbiran s skupino salmonele, O-aglutinacijski serum proti koleri). Imunizacija s H- in O-antigeni proizvaja serume s H- in O-protitelesi.

Poleg tega O-aglutinini dajejo drobnozrnat aglutinat, H-aglutinini pa dajejo grobo zrnato oborino.

3. Elektrolit - izotonična raztopina NaCl (0,9% raztopina natrijevega klorida, pripravljena z destilirano vodo).

Obstajata dve glavni metodi za postavitev reakcije aglutinacije: reakcija na steklu (včasih imenovana indikativna ali lamelarna) in razširjena reakcija (v epruvetah).

Izjava o reakciji aglutinacije na steklu. Na stekelce brez maščobe nanesemo dve kapljici seruma in kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida. Diagnostični aglutinacijski serum se vzame v eni razredčini, ki je glede na njegov titer 1:10, 1:25, 1:50 ali 1:100. V eno od kapljic seruma in kapljico izotonične raztopine se z zanko vnese kultura proučevanega mikroorganizma in temeljito premeša. Kapljica natrijevega klorida z mikroorganizmi je antigenska kontrola, kapljica seruma brez mikroorganizmov je serumska kontrola. Ne prenašajte kulture iz kapljice seruma v kapljico NaCl. Reakcija poteka pri sobni temperaturi 1–3 minute. Če kontrola seruma ostane bistra, opazimo enakomerno motnost v kontroli antigena in se v kapljici, kjer se kultura pomeša s serumom, pojavijo aglutinirani kosmiči, se rezultat šteje za pozitiven. Če je v kapljici s serumom in antigenom enakomerna motnost, je to negativen rezultat. Reakcija je bolj jasno vidna na temnem ozadju.

Serum

1. kontrola antigena

2. kontrola seruma

imunodiagnostične reakcije. Reakcije antigen-protitelo in reakcije z označenimi komponentami. Uporaba za identifikacijo mikroorganizmov in diagnostične namene nalezljive bolezni.

Imunske reakcije se uporabljajo v diagnostičnih in imunoloških študijah pri bolnikih in zdravi ljudje. V ta namen se prijavite serološke metode(iz lat. serum - serum in logotipi - doktrina), tj. metode za preučevanje protiteles in antigenov z uporabo reakcij antigen-protitelo, določenih v krvnem serumu in drugih tekočinah ter telesnih tkivih.

Odkrivanje protiteles proti antigenom patogena v krvnem serumu pacienta omogoča diagnosticiranje bolezni. Serološke študije se uporabljajo tudi za identifikacijo mikrobnih antigenov, različnih biološko aktivnih snovi, krvnih skupin, tkivnih in tumorskih antigenov, imunskih kompleksov, celičnih receptorjev itd.

Ko mikrob izoliramo od pacienta, identificiramo povzročitelja s proučevanjem njegovih antigenskih lastnosti z uporabo imunskih diagnostičnih serumov, to je krvnih serumov hiperimuniziranih živali, ki vsebujejo specifična protitelesa. Ta t.i serološka identifikacija mikroorganizmi.

V mikrobiologiji in imunologiji se pogosto uporabljajo reakcije aglutinacije, precipitacije, nevtralizacijske reakcije, reakcije, ki vključujejo komplement, z uporabo označenih protiteles in antigenov (radioimunološki, encimski imunski test, metode imunofluorescence). Naštete reakcije se razlikujejo po registriranem učinku in tehniki postavljanja, vendar so vse bazične. na reakcijo interakcije antigena s protitelesom in se uporabljajo za odkrivanje tako protiteles kot antigenov. Za imunske reakcije je značilna visoka občutljivost in specifičnost.

Spodaj so podani principi in sheme glavnih imunodiagnostičnih reakcij. Podrobna tehnika za nastavitev reakcij je podana v. praktične smernice za imunodiagnostiko.

Aglutinacijska reakcija - RA(iz lat. agluti- natio- bonding) - preprosta reakcija, pri kateri protitelesa vežejo korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ali druge celice, netopne delce z adsorbiranimi antigeni na njih, pa tudi makromolekularne agregate). Pojavi se v prisotnosti elektrolitov, na primer, ko dodamo izotonično raztopino natrijevega klorida.

Uporabljajo se različne različice reakcije aglutinacije: razširjena, približna, posredna itd. Reakcija aglutinacije se kaže v tvorbi kosmičev ali usedlin.

RA se uporablja za:

določanje protiteles v krvnem serumu bolnikov, na primer z brucelozo (reakcije Wright, Heddelson), tifus in paratifus (reakcija Vidal) in druge nalezljive bolezni;

določitev patogena, izoliranega od bolnika;

določanje krvnih skupin z uporabo monoklonskih protiteles proti eritrocitnim alogenom.

Za določitev bolnikovih protiteles postavitipodaljšana reakcija aglutinacije: dodajte razredčitvam bolnikovega krvnega seruma diagnosticum(suspenzija ubitih mikrobov) in po nekaj urah inkubacije pri 37 °C opazimo največjo razredčitev seruma (serumski titer), pri kateri je prišlo do aglutinacije, tj. do nastanka oborine.

Narava in hitrost aglutinacije sta odvisni od vrste antigena in protiteles. Primer je interakcija diagnostikumov (O- in R-antigenov) s specifičnimi protitelesi. Aglutinacijska reakcija z O-diagnostikum(bakterije ubije toplota, ohranijo termostabilen O antigen) poteka v obliki drobnozrnate aglutinacije. Aglutinacijska reakcija s H-diagnosticumom (bakterije, ki jih ubije formalin, obdrži toplotno labilen flagelarni H-antigen) je grobozrnata in poteka hitreje.

Če je treba določiti patogen, izoliran od pacienta, postavite orientacijska reakcija aglutinacije, z uporabo diagnostičnih protiteles (aglutinacijski serum), tj. Izvede se serotipizacija patogena. Približno reakcijo izvedemo na stekelcu. Kapljici diagnostičnega aglutinacijskega seruma v razredčini 1:10 ali 1:20 dodamo čisto kulturo povzročitelja, izoliranega od bolnika. V bližini je postavljena kontrola: namesto seruma se nanese kapljica raztopine natrijevega klorida. Ko se v kapljici pojavi kosmičasta usedlina s serumom in mikrobi, dajo obsežna reakcija aglutinacije v epruvetah z naraščajočimi razredčinami aglutinacijskega seruma, ki mu dodamo 2-3 kapljice suspenzije patogena. Aglutinacija se upošteva glede na količino usedline in stopnjo zbistrenosti tekočine. Reakcija se šteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčitvi blizu titra diagnostičnega seruma. Hkrati se upoštevajo kontrole: serum, razredčen z izotonično raztopino natrijevega klorida, mora biti prozoren, suspenzija mikrobov v isti raztopini mora biti enakomerno motna, brez usedline.

Različne sorodne bakterije je mogoče aglutinirati z istim diagnostičnim aglutinacijskim serumom, kar oteži njihovo identifikacijo. Zato, uživajte adsorbirani aglutinacijski serumi, iz katerih so bila navzkrižno reaktivna protitelesa odstranjena z adsorpcijo sorodnih bakterij. V takih serumih ostanejo protitelesa, specifična samo za to bakterijo. Pripravo monoreceptorskih diagnostičnih aglutinacijskih serumov na ta način je predlagal A. Castellani (1902).

Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RNHA, RPHA) temelji na uporabi eritrocitov z antigeni ali protitelesi, adsorbiranimi na površini, katerih interakcija z ustreznimi protitelesi ali antigeni krvnega seruma kroglice povzroči, da se eritrociti zlepijo in padejo na dno. epruveto ali celico v obliki nazobčanega sedimenta (slika 13.2). pri povratni udarec eritrociti se usedejo v obliki "gumba". Običajno se protitelesa odkrijejo v RNHA z uporabo antigenskega eritrocitnega diagnostika, ki je eritrocit z adsorbirano na ti antigeni. Včasih uporabljamo protitelesno diagnostiko eritrocitov, na katere se adsorbirajo protitelesa. Na primer, botulinski toksin lahko odkrijemo tako, da mu dodamo eritrocitno protitelo botulinum diagnosticum (to reakcijo imenujemo reakcija povratne indirektne hemaglutinacije- RONGA). RNHA se uporablja za diagnosticiranje nalezljivih bolezni, določanje gonadotropnega hormona v urina med ugotavljanjem nosečnosti, za odkrivanje preobčutljivosti na zdravila, hormoni in v nekaterih drugih primerih.

Reakcija koaglutinacije . Patogene celice se določijo s pomočjo stafilokokov, predhodno obdelanih z imunskim diagnostičnim serumom. Protein, ki vsebuje stafilokoke AMPAK, imeti afiniteto do Fc -fragment imunoglobulinov, nespecifično adsorbira protimikrobna protitelesa, ki nato sodelujejo z aktivnimi centri z ustreznimi mikrobi, izoliranimi od bolnikov. Kot posledica koaglutinacije nastanejo kosmiči, sestavljeni iz stafilokokov, diagnostičnih serumskih protiteles in določenega mikroba.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji na blokadi, zatiranju antigenov virusov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutinacije rdečih krvnih celic (slika 13.3). RTHA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, klopni encefalitis itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.

Aglutinacijska reakcija za določanje krvnih skupin uporablja se za vzpostavitev sistema ABO (glej poglavje 10.1.4.1) z uporabo aglutinacije eritrocitov s protitelesi imunskega seruma proti antigenom krvnih skupin A (II), B (III). Kontrole so: serum brez protiteles, tj AB (GU) krvne skupine; antigeni, ki jih vsebujejo eritrociti skupin A (II), B (III). Negativna kontrola ne vsebuje antigenov, tj. uporabljeni so eritrociti skupine 0 (I).

AT aglutinacijske reakcije za določanje Rh faktorja(glejte poglavje 10.1.4.1) uporabite anti-Rh serume (vsaj dve različni seriji). V prisotnosti antigena Rh na membrani proučevanih eritrocitov pride do aglutinacije teh celic. Za kontrolo služijo standardni Rh-pozitivni in Rh-negativni eritrociti vseh krvnih skupin.

Aglutinacijska reakcija za določanje protiteles proti rezusu ( posredna reakcija Coombs)Uporablja se pri bolnikih z intravaskularno hemolizo. Pri nekaterih od teh bolnikov najdemo protitelesa proti rezusu, ki so nepopolna, monovalentna. Posebej interagirajo z Rh-pozitivnimi eritrociti, vendar ne povzročajo njihove aglutinacije. Prisotnost takšnih nepopolnih protiteles ugotavljamo v indirektni Coombsovi reakciji. Da bi to naredili, sistemu anti-Rh protiteles + Rh-pozitivnih eritrocitov dodamo antiglobulinski serum (protitelesa proti človeškim imunoglobulinom), kar povzroči aglutinacijo eritrocitov (slika 13.4). Z uporabo Coombsove reakcije se diagnosticirajo patološka stanja, povezana z intravaskularno lizo eritrocitov imunskega izvora, na primer hemolitična bolezen novorojenčka: eritrociti Rh-pozitivnega ploda se združijo z nepopolnimi protitelesi proti Rh faktorju, ki kroži v krvi, ki prečka posteljica Rh-negativne matere.

Precipitacijske reakcije

reakcija padavin - RP (izlat. praeci-pito- oborina,) je tvorba in precipitacija kompleksa topnega molekularnega antigena s protitelesi v obliki motnosti, imenovane oborina. Nastane z mešanjem antigenov in protiteles v enakih količinah; presežek enega od njih zmanjša stopnjo tvorbe imunskega kompleksa.

Reakcije obarjanja vstavite v epruvete (reakcija obarjanja obroča), v gelih, hranilnih medijih itd. Široko se uporabljajo različice reakcije obarjanja v poltekočem gelu agarja ali agaroze: dvojna imunodifuzija po Ouchterlonyju. radialna imunodifuzija, imunoelektroforeza in itd.

Obročna precipitacijska reakcija . Reakcijo izvajamo v ozkih obarjevalnih epruvetah z imunskim serumom, na katerega je nanesen topni antigen. Z optimalnim razmerjem antigena in protiteles se na meji teh dveh raztopin oblikuje neprozoren precipitatni obroč (slika 13.5). Presežek antigena ne vpliva na rezultat reakcije obarjanja obroča zaradi postopne difuzije reagentov do tekoče meje. Če kot antigene v reakciji obarjanja obroča uporabimo prekuhane in filtrirane vodne izvlečke organov ali tkiv, potem takšno reakcijo imenujemo reakcija termoprecipitacije-iii (Ascolijeva reakcija, z antraksom /

Oukhterunijeva dvojna imunodifuzijska reakcija . Za postavitev reakcije stopljeni agar gel vlijemo v tankem sloju na stekleno ploščo in ko se strdi, vanj izrežemo luknjice velikosti 2-3 mm. Antigeni in imunski serumi so nameščeni ločeno v te vdolbinice, ki difundirajo drug proti drugemu. Na stičnem mestu v enakih razmerjih tvorijo oborino v obliki belega traku. V večkomponentnih sistemih se med vdolbinicami z različnimi antigeni in serumskimi protitelesi pojavi več linij oborine; pri enakih antigenih se precipitatne črte združijo; pri neenakih se sekajo (slika 13.6).

Radialna imunodifuzijska reakcija . Imunski serum s staljenim agar gelom enakomerno vlijemo na kozarec. Po strjevanju v gelu naredimo vdolbinice, v katere damo antigen v različnih razredčinah. Antigen, ki difundira v gel, tvori obročaste precipitacijske cone okoli vdolbinic s protitelesi (slika 13.7). Premer precipitacijskega obroča je sorazmeren s koncentracijo antigena. Reakcija se uporablja za določanje ravni imunoglobulinov različnih razredov v krvi, komponent sistema komplementa itd.

Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze in imunoprecipitacije: zmes antigenov vnesemo v jamice gela in jih v gelu ločimo z elektroforezo. Nato vzporedno s conami elektroforeze v utor vnesemo imunski serum, katerega protitelesa, ki difundirajo v gel, nastanejo na stičišču z antigenom precipitacijske linije.

reakcija flokulacije(po Ramonu) (iz lat. kosmiči- volneni kosmiči) - pojav opalescence ali flokulentne mase (imunoprecipitacija) v epruveti med reakcijo toksin-antitoksin ali anatoksin-antitoksin. Uporablja se za določanje aktivnosti antitoksičnega seruma ali toksoida.

Imunska elektronska mikroskopija- elektronsko mikroskopiranje mikrobov, pogosteje virusov, tretiranih z ustreznimi protitelesi. Virusi, tretirani z imunskim serumom, tvorijo imunske agregate (mikroprecipitate). Okoli virionov se oblikuje "venček" protiteles, v nasprotju s fosfovolframovo kislino ali drugimi elektronsko optično gostimi pripravki.

Reakcije, ki vključujejo komplement

Reakcije, ki vključujejo komplementki temelji na aktivaciji komplementa s kompleksom antigen-protitelo (reakcija fiksacije komplementa, radialna hemoliza itd.).

Reakcija fiksacije komplementa (RSK) je v tem, da antigeni in protitelesa, ko si medsebojno ustrezajo, tvorijo imunski kompleks, na katerega preko Fc -fragment protiteles se pridruži komplementu (C), tj. do vezave komplementa pride s kompleksom antigen-protitelo. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost (slika 13.8). RSK poteka v dveh fazah: 1. faza - inkubacija mešanice, ki vsebuje tri komponente antigen + protitelo + komplement; 2. faza (indikator) - odkrivanje prostega komplementa v mešanici z dodajanjem hemolitičnega sistema, sestavljenega iz ovčjih eritrocitov in hemolitičnega seruma, ki vsebuje protitelesa proti njim. V 1. fazi reakcije med tvorbo kompleksa antigen-protitelo pride do vezave komplementa, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize eritrocitov, senzibiliziranih s protitelesi; reakcija je pozitivna. Če se antigen in protitelo ne ujemata (v testnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu eritrocit-antieritrocitno protitelo, kar povzroči hemolizo; reakcija je negativna.

RSK se uporablja za diagnosticiranje številnih nalezljivih bolezni, zlasti sifilisa (Wassermanova reakcija).

Reakcija radialne hemolize (RRH ) damo v jamice agar gela, ki vsebuje ovčje eritrocite in komplement. Po dodajanju hemolitičnega seruma (protitelesa proti ovnovim eritrocitom) v vdolbinice gela nastane okoli njih območje hemolize (kot posledica radialne difuzije protiteles). Tako je mogoče določiti aktivnost komplementa in hemolitičnega seruma ter protiteles v krvnem serumu bolnikov z gripo, rdečkami, klopnim encefalitisom. Da bi to naredili, se ustrezni antigeni virusa adsorbirajo na eritrocitih, pacientov krvni serum pa se doda v jamice gela, ki vsebuje te eritrocite. Protivirusna protitelesa medsebojno delujejo z virusnimi antigeni, adsorbiranimi na eritrocitih po tem

Komponente komplementa se vežejo na ta kompleks in povzročijo hemolizo.

Imunska adhezijska reakcija (RIP ) temelji na aktivaciji sistema komplementa s korpuskularnimi antigeni (bakterije, virusi), obdelanimi z imunskim serumom. Posledično nastane aktivirana tretja komponenta komplementa (C3b), ki se kot del imunskega kompleksa veže na korpuskularni antigen. Na eritrocitih, trombocitih, makrofagih so receptorji za C3b, zaradi česar se te celice, ko se pomešajo z imunskimi kompleksi, ki nosijo C3b, združijo in aglutinirajo.

Reakcija nevtralizacije

Protitelesa v imunskem serumu so sposobna nevtralizirati škodljiv učinek mikrobov ali njihovih toksinov na občutljive celice in tkiva, kar je povezano z blokado mikrobnih antigenov s protitelesi, tj. nevtralizacija. Reakcija nevtralizacije(RN) se izvede z vnosom mešanice antigen-protitelo v živali ali v občutljive testne predmete (celična kultura, zarodki). V odsotnosti škodljivega učinka mikroorganizmov ali njihovih antigenov, toksinov na živalih in testnih objektih govorijo o nevtralizirajočem učinku imunskega seruma in s tem o specifičnosti interakcije kompleksa antigen-protitelo (slika 13.9).

Imunofluorescenčna reakcija - RIF (Koonsova metoda)

Obstajajo tri glavne različice metode: neposredna, posredna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je hitra diagnostična metoda za odkrivanje mikrobnih antigenov ali odkrivanje protiteles.

Neposredna metoda RIF temelji na dejstvu, da lahko tkivni antigeni ali mikrobi, obdelani z imunskimi serumi s protitelesi, označenimi s fluorokromi, svetijo v UV žarkih fluorescentnega mikroskopa.

Bakterije v brisu, obdelanem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo po obodu celice v obliki zelene obrobe.

Posredna metoda RIF je identificirati kompleks antigen-protitelo z uporabo seruma antiglobulina (protitelesa), označenega s fluorokromom. Da bi to naredili, brise iz suspenzije mikrobov obdelamo s protitelesi protimikrobnega kunčjega diagnostičnega seruma. Nato protitelesa, ki niso vezana na mikrobne antigene, speremo, protitelesa, ki ostanejo na mikrobih, pa odkrijemo z obdelavo brisa z antiglobulinskim (anti-kunčjim) serumom, označenim s fluorokromi. Posledično nastane kompleks mikroba + protimikrobna kunčja protitelesa + antikunčja protitelesa, označena s fluorokromom. Ta kompleks opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom, kot pri direktni metodi.

Metoda ELISA ali analiza (ELISA)

ELISA -odkrivanje antigenov z uporabo ustreznih protiteles, konjugiranih z označevalnim encimom (hrenova peroksidaza, beta-galaktozidaza ali alkalna fosfataza). Potem ko je bil antigen kombiniran z encimsko označenimi imunskimi serumi, se zmesi doda substrat/kromogen. Substrat razcepi encim, barva reakcijskega produkta pa se spremeni – intenzivnost barve je premosorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.

ELISA v trdni fazi - najpogostejša različica imunološkega testa, ko je ena od komponent imunskega odziva (antigen ali protitelesa) adsorbirana na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih plošč.

Pri določanju protiteles se v vdolbinice plošč z adsorbiranim antigenom zaporedno dodaja bolnikov krvni serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat (kromogen) za encim.

Vsakič po dodatku naslednje komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s temeljitim izpiranjem. pri pozitiven rezultat spremeni se barva raztopine kromogena. Trdnofazni nosilec lahko senzibiliziramo ne le z antigenom, ampak tudi s protitelesi. Nato v vdolbinice z adsorbiranimi protitelesi vnesemo želeni antigen, dodamo imunski serum proti z encimom označenim antigenom in nato še substrat za encim.

Konkurenčna ELISA . tarčni antigen in z encimom označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejene količine protiteles v imunskem serumu. Drugi test so protitelesa, ki jih iščete

in označena protitelesa tekmujejo med seboj za antigene.

Radioimunološka metoda ali analiza (RIA)

Zelo občutljiva metoda, ki temelji na reakciji antigen-protitelo z uporabo antigenov ali protiteles, označenih z radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Po njunem medsebojnem delovanju se nastali radioaktivni imunski kompleks loči in določi njegova radioaktivnost v ustreznem števcu (beta ali gama sevanje):

jakost sevanja je premosorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.

pri trdnofazna različica RIA ena od reakcijskih komponent (antigen ali protitelesa) je adsorbirana na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih mikromrež. Druga različica metode je konkurenčni RIA. tarčni antigen in z radionuklidi označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejene količine protiteles v imunskem serumu. Ta možnost se uporablja za določanje količine antigena v testnem materialu.

RIA se uporablja za odkrivanje mikrobnih antigenov, določanje hormonov, encimov, zdravilne snovi in imunoglobulini, pa tudi druge snovi, ki jih preskusni material vsebuje v manjših koncentracijah - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda predstavlja določeno nevarnost za okolje.

Imunobloting

Imunobloting (IB)- zelo občutljiva metoda, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA.

Antigen izoliramo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato ga prenesemo (blotiranje - iz angl. madež, spot) iz gela na aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in razvit z ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z "blot"

antigeni. Na te trakove se nanese bolnikov serum. Nato po inkubaciji bolnika speremo z nevezanih protiteles bolnika in apliciramo serum proti humanim imunoglobulinom, označen z encimom. Kompleks antigen + protitelo bolnika + protitelo proti humanemu Ig, ki nastane na traku, se odkrije z dodajanjem substrata / kromogena, ki spremeni barvo pod delovanjem encima (slika 13.12).

IB se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

Aglutinacija je aglutinacija in obarjanje mikrobov ali drugih celic pod delovanjem protiteles v prisotnosti elektrolita (izotonične raztopine natrijevega klorida). Skupine lepljivih bakterij (celic) imenujemo aglutinati. Za reakcijo aglutinacije so potrebne naslednje komponente:

1. Protitelesa (aglutinini), ki so v serumu bolne ali imune živali.

2. Antigen - suspenzija živih ali mrtvih mikrobov, eritrocitov ali drugih celic.

3. Izotonična (0,9%) raztopina natrijevega klorida.

Aglutinacijsko reakcijo za serodiagnozo uporabljamo pri tifusu in paratifusu (Vidalova reakcija), pri brucelozi (Wrightova in Huddlesonova reakcija), tularemiji itd. V tem primeru je bolnikov serum protitelo, znani mikrob pa antigen. Ko so mikrobi ali druge celice identificirani, njihova suspenzija služi kot antigen, znani imunski serum pa kot protitelo. Ta reakcija se pogosto uporablja za diagnosticiranje črevesne okužbe, oslovski kašelj itd.

Metode določanja stopnje RA

Približen RA na steklu

Razporejen RA

(volumetrična metoda)

Reakcija koaglutinacije

Razširjeni RA na steklu (seroidentifikacija)

Reakcija aglutinacije na steklu. Na stekelce brez maščobe nanesemo dve kapljici specifičnega (adsorbiranega) seruma in kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida. Neadsorbirane serume predhodno razredčimo v razmerju 1:5 - 1:100. Kapljice na steklo je treba nanesti tako, da je med njimi razdalja. Kulturo temeljito zdrgnemo z zanko ali pipeto na kozarec, nato dodamo kapljici izotonične raztopine natrijevega klorida in eni kapljici seruma, pri čemer vsako mešamo, dokler ne nastane homogena suspenzija. Serumska kapljica brez kulture je serumska kontrola.

Pozor! Kulture seruma ne smete prenesti v kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida, ki je kontrola antigena. Reakcija poteka pri sobni temperaturi 1–3 minute. Če kontrola seruma ostane prozorna, opazimo enakomerno motnost v kontroli antigena in kosmiči aglutinata se pojavijo na ozadju bistre tekočine v kapljici, kjer je kultura pomešana s serumom, se rezultat reakcije šteje za pozitiven.

Diagnostični fiziološki

serum + raztopina kulture + kultura

Razširjena reakcija aglutinacije (volumetrična metoda). Serumske razredčitve pripravljamo v zaporednih, največkrat dvakratnih razredčitvah. Metoda se imenuje bulk. Za določitev titra protiteles v krvnem serumu vzemite 6 epruvet. V prvo epruveto vlijemo 1 ml začetne razredčine seruma 1:50 in v vseh 6 epruvet z graduirano pipeto dodamo po 1 ml fiziološke raztopine. V prvi epruveti dobimo razredčino seruma 1:100 z volumnom 2 ml. Iz prve epruvete prenesite 1 ml v drugo epruveto, kjer postane razredčitev 1:200. Zato naredite vrsto serijskih razredčitev seruma v prvih 5 epruvetah (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Vlijte 1 ml iz pete epruvete v razkužilno raztopino. Dodajte 2 kapljici diagnostikuma v vseh 6 epruvet. Šesta epruveta je kontrolna kultura, saj vsebuje samo fiziološko raztopino in diagnostik.

Tak nadzor je potreben za izključitev spontane aglutinacije kulture. Epruvete pretresemo in za 2 uri postavimo v termostat pri temperaturi 37 °C, nato pustimo en dan pri sobni temperaturi, nato pa zabeležimo rezultate reakcije aglutinacije. Pri postavljanju aglutinacijske reakcije s serumi otrok v prvih mesecih življenja je zaradi funkcionalne inferiornosti tvorbe protiteles potrebno določiti nižje titre protiteles, kar se upošteva pri redčenju seruma. Začetno razredčitev seruma je 1:25. V prvi epruveti dobimo razredčino 1:50, nato 1:100 itd.

S pozitivnim rezultatom reakcije so v epruvetah na ozadju bistre tekočine vidne lepljive celice v obliki zrn ali kosmičev. Aglutinat se postopoma usede na dno v obliki »dežnika«, tekočina nad usedlino pa postane bistra. Antigenska kontrola je enakomerno motna.

Po naravi usedline ločimo drobnozrnato in grobo zrnato (kosmičem) aglutinacijo. Pri delu z O-serumi se doseže drobnozrnata aglutinacija. Grobozrnat - med interakcijo gibljivih mikrobov z flagelarnimi H-serumi. Prihaja hitreje kot drobnozrnat, nastala usedlina je zelo ohlapna in zlahka zlomljiva.

Intenzivnost reakcije je izražena na naslednji način:

Vse celice so se usedle, tekočina v epruveti je popolnoma prozorna. Rezultat reakcije je izrazito pozitiven;

Usedline je manj, popolne razsvetlitve tekočine ni. Rezultat reakcije je pozitiven;

Usedline je še manj, tekočina je bolj motna. Rezultat reakcije je dvomljiv;

na dnu epruvete je neznatna usedlina, tekočina je motna. Dvomljiv rezultat reakcije;

Sedimenta ni, tekočina je enakomerno motna, kot pri antigenski kontroli. Negativen rezultat reakcije