İmmünoblotlama HIV pozitif. AIDS, HIV İmmünoblot için immünoblot ile nasıl teşhis edilir - nedir? Bulaşıcı hastalıkların tanısında immünoblot

MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 reaktif kiti, serum veya plazmada HIV-1 ve/veya HIV-1 grup O ve/veya HIV-2'nin tek tek proteinlerine (antijenlerine) karşı antikorların saptanmasını doğrulamak için tasarlanmıştır. insan kanı immünoblot yöntemi.

Ayırt edici özellikleri:

"MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" reaktif seti, HIV 1 ve peptit - HIV-2 gp36 antijenik determinatın saflaştırılmış lizat viral proteinlerini içerir;
Bir şeritte HIV-1, HIV-1 grup O, HIV 2'ye karşı antikorların saptanmasını sağlar;
Analizleri hazırlamak ve yürütmek için basit bir prosedür;
Reaksiyonun dahili kalite kontrolü*
Analizin maksimum hızı (3 saat);
Test numunesinin küçük bir hacmi - 20 µl;
Araştırma için ek ekipman gerektirmez;
Kitin kalitesi, Rus ve uluslararası standart numunelerin kullanılmasıyla garanti edilmektedir**

* İç kalite kontrolü aşağıdakilerin varlığı ile sağlanır:

dahili kontrol şeritleri, bir serum veya plazma numunesinin girişinin kontrolünü sağlar;
kontrol negatif serum (K-);
şerit üzerinde tespit edilen bantları tanımlamaya izin veren kontrol pozitif serumu (K+);
reaktif kitinin duyarlılığının kontrolünü sağlayan zayıf pozitif serumu (K + cl) kontrol edin.

**Kalite güvencesi:

MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 reaktif kitinin özellikleri, rastgele bir donör numunesinin numunelerinin test edilmesiyle belirlendi. HIV enfeksiyonu, ticari serokonversiyon panelleri, standart paneller ve "potansiyel olarak enterferans yapan" bileşenlere sahip örnekler.

Reaktif kiti, HIV 1.2 ve HIV-1 antijenine karşı antikorlar içermeyen standart panelin serumlarının çalışmasında yanlış pozitif sonuçlar vermez ("Standart AT (-) HIV", No. FSR 2007/00953 / 10/ 25/2007). Özgüllük - %100.

Teşhis özgüllüğü, önceden onaylanmış HIV-1, HIV-2 enfeksiyonu olmayan çeşitli kan merkezlerinden ve kliniklerden 200 donörden oluşan rastgele bir örnek üzerinde çalışılarak belirlendi. Rastgele bir donör örneğinin çalışmasında özgüllük %100 idi;

Reaktif kitinin özgüllüğü, hamile kadınlardan, hastanede yatan hastalardan, hepatit C ve E hastalarından alınan serum veya plazma numuneleri ve "potansiyel olarak enterferans yaratan belirleme" bileşenleri içeren numuneler dahil olmak üzere 250 numunenin çalışmasında belirlendi. MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 kiti kullanıldığında, bu numuneler için yanlış pozitif sonuç bulunamadı.

Teşhis duyarlılığı aşağıdakiler kullanılarak belirlendi:
- Boston Biomedica, Inc. Farklı HIV-1 alt tiplerini içeren farklı bölgelerden HIV-1 panel plazma örnekleri (WWRB 301): grup M (alt tipler A, B, C, D, E, F) ve grup O; reaktif kitinin duyarlılığı %100'dü;

Reaktif kitinin duyarlılığı, uluslararası serokonversiyon panelleri Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932, PRB 940

Reaktif kiti, HIV-1 antikorları içeren standart bir panelin serumlarında HIV-1 antikorlarını tespit eder (“Standart AT (+) HIV-1”, No. FSR 2007/00953, 25 Ekim 2007 tarihli), antikorları tespit eder HIV-2'ye karşı antikorlar içeren standart panelin serumunda HIV-2'ye ("Standart AT (+) HIV-2", No. FSR 2007/00953, 10/25/2007). Hassasiyet - %100.

13 Temmuz 2011 tarihli FSR 2010/07958 numaralı tescil belgesi (geçerlilik sınırlı değildir)

Birleştirmek:

İmmünosorbent. Bireysel HIV-1 proteinleri (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) ile üzerlerine elektrotransfer yöntemiyle adsorbe edilen ve sentetik bir HIV-2 peptidi ile şeride uygulanan beyaz nitroselüloz membran şeritleri, gp36 proteininin bir analoğu ve insan anti-IgG (iç kontrol) - 18 adet;
K- - kontrol negatif serum. HIV-1,2, HCV, HIV antijeni, HBsAg'ye karşı antikorlar içermeyen insan kan serumu, 560C'de ısıtılarak inaktive edilir; şeffaf açık sarı sıvı - 1 test tüpü (0.08 mi). Koruyucular içerir: timerosal ve sodyum azid;
K+ - kontrol pozitif serum. HIV-1,2'ye karşı antikorlar içeren (titre 1:10000'den az olmayan), HBsAg, HIV antijeni, HCV'ye karşı antikorlar içermeyen, 560C'de ısıtılarak inaktive edilmiş insan kan serumu; şeffaf açık sarı sıvı - 1 test tüpü (0.08 ml) Koruyucu içerir: timerosal ve sodyum azid;
K+sl - zayıf pozitif serumu kontrol edin. HIV-1,2'ye karşı antikorlar içeren (titre 1:200'den fazla olmayan), HBsAg, HIV antijeni, HCV'ye karşı antikorlar içermeyen, 560C'de ısıtılarak inaktive edilmiş insan kan serumu; şeffaf açık sarı sıvı - 1 test tüpü (0.08 mi). Koruyucular içerir: timerosal ve sodyum azid;
RROKk (x10) - numunelerin ve konjugatların seyreltilmesi için çözelti. Konsantre - Ön işleme tabi tutulmuş normal keçi serumu içeren Tris tamponu; opak gri sıvı - 1 şişe (10 mi). Koruyucu içerir: timerosal;
PRk (x20) - yıkama solüsyonu. Konsantre - Tween-20 içeren Tris tamponu; berrak renksiz sıvı - 1 şişe (70 mi). Koruyucu içerir: timerosal;
Eşlenik. Alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş insan IgG'sine karşı keçi antikorları; berrak renksiz sıvı - 1 test tüpü (0.06 mi);
Substrat (renklendirme solüsyonu). 5-bromo-4-floro-indolil-fosfat (BCIP) ve nitrosin tetrazolyum (NBT) çözeltisi; şeffaf açık sarı sıvı - 1 şişe (50 mi);
için toz bağışıklık lekesi. Yağsız süt tozu - amorf beyaz veya açık sarı toz - 5 paket x 1g;
Reaksiyon oluşturmak için kapaklı bir tablet - 2 adet;
Plastik cımbız - 1 adet.

immünoblotlama -(İngilizce "leke" - spottan) - bilinen serumları (veya antijenleri) kullanarak antijenleri (veya antikorları) tanımlama yöntemi. ELISA ile jel elektroforezinin bir kombinasyonudur. İlk olarak, bakteri hücreleri veya viryonlar ultrason kullanılarak yok edilir ve daha sonra virüs veya bakteri hücrelerinin tüm antijenleri elektroforez ile ayrılır ve özel bir nitroselüloz film üzerinde ticari bir reaktif elde edilir. İmmünoblotlama kurulurken, bilinen antijenlere sahip filme hastanın test serumu uygulanır. Bağlanmamış antikorların inkübasyonundan ve yıkanmasından sonra, filme uygulanan bir enzimle etiketlenmiş insan immünoglobulinlerine karşı bir antiserum ve enzimle etkileşime girdiğinde renk değiştiren bir kromojenik substrat olan ELISA'ya geçerler. İmmünoglobulin-enzim komplekslerine karşı antijen-antikor-antiserum varlığında, taşıyıcı üzerinde renkli noktalar belirir. İmmünoblotlama yöntemi, patojenin çeşitli antijenlerine karşı antikorları ayrı ayrı tespit etmenizi sağlar (örneğin, HIV enfeksiyonunda, immünoblotlama, gp120, gp24 ve virüsün diğer antijenlerine karşı antikorları tespit eder).

Radyoimmunoassay (RIA)

Yöntem, bir radyonüklid ile bir antijen veya antikor etiketi kullanılarak antijen-antikor reaksiyonuna dayanır. 125I, 14C, 3H, 51Cr ve diğer radyonüklidler etiket olarak kullanılır. Ortaya çıkan bağışıklık kompleksleri sistemden izole edilir ve radyoaktiviteleri sayaçlarda belirlenir (β-radyasyonu). Radyasyon yoğunluğu, bağlı antijen ve antikor moleküllerinin sayısı ile doğru orantılıdır.

Polistiren panellerin kuyularında adsorbe edilen etiketli antikorları veya antijenleri kullanan RIA'nın katı faz versiyonu yaygın olarak kullanılmaktadır.

RIA, mikropların, virüslerin, çeşitli hormonların, enzimlerin antijenlerini tespit etmek için kullanılır. tıbbi maddeler, immünoglobulinler ve ayrıca test materyalinde 10-12–10-15 g/l'lik küçük konsantrasyonlarda bulunan diğer maddeler.

sınav soruları

İmmün bakteriyoliz reaksiyonu: ne tür bir reaksiyondur; antijen nedir, antikor nedir, reaksiyon mekanizması, yerleştirme yöntemleri, pratik uygulama. İmmün hemoliz reaksiyonu: gerekli bileşenler, sertleşme yöntemi; kontroller, pratik uygulama. Jelde lokal hemoliz reaksiyonu (Yerne reaksiyonu): reaksiyonun prensibi, formülasyon yöntemi, pratik uygulama. Kompleman fiksasyon reaksiyonu: reaksiyon prensibi; bağışıklık serumu belirli bir antijen ile etkileşime girdiğinde ne oluşur; bu etkileşimde varsa tamamlayıcıya ne olur? Antijen ve antikorlar arasında spesifik bir afinite yoksa komplemanın akıbeti nedir? Tamamlayıcıya ne olduğunu belirlemek için hangi reaksiyon kullanılabilir; bu reaksiyon neden kullanılır; görünen nedir olumlu sonuç RSK? Neden? Niye? CSC'nin ilk aşamasında tamamlayıcının hangi özelliği kullanılır? İkinci aşamada mı? RSK'nın sonucu hemoliz ise, bu ne anlama gelir - pozitif veya olumsuz sonuç? Sonuçları açıklayın: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Birinci RSK sisteminin bileşenlerini ve ikinci RSK sisteminin bileşenlerini adlandırın. Test serumunun neden inaktive edilmesi gerekiyor? Kompleman nasıl titre edilir? Hemolitik serum: Ne içerir, nasıl elde edilir, titre nedir ve nasıl belirlenir? RSC bileşenlerini elde etmek için hangi hayvanlar kullanılır? RSC'yi soğukta ayarlama tekniği. Aşağıdaki reaksiyonlardan hangisini evrelerken, bir tamamlayıcının katılımı gereklidir: çökeltme, flokülasyon, aglütinasyon, eksik antikorların tespiti, immün bakteriyoliz, immün hemoliz, Jerne, CSC? İmmünofloresan reaksiyonu (RIF) - doğrudan Coons reaksiyonundaki olayların sırasını gösterir; gerekli malzemeler. Antijen nedir, antikor nedir, antikorlar nasıl etiketlenir, reaksiyon sonucu nasıl dikkate alınır, pozitif sonuç neye benzer? Pratik uygulama - bu reaksiyon kullanılarak ne belirlenebilir? dolaylı reaksiyon immünofloresan - bu reaksiyondaki olayların sırasını, gerekli bileşenleri, antijenin ne olduğunu, hangi immün serumların kullanıldığını belirtin; pratik kullanım; dolaylı RIF'nin doğrudan reaksiyona göre avantajı. Enzim immünoassay (ELISA) - reaksiyonun prensibi; gerekli malzemeler; test materyalindeki bir antijeni tespit etmek için bir reaksiyon oluştururken olayların sırasını belirtmek; gerekli malzemeler; olumlu bir sonuçla ne olur, neye benziyor? Test serumundaki antikorları saptamak için ELISA sırasındaki eylemlerin sırasını belirtin; gerekli malzemeler; olumlu bir sonuçla ne olur? İmmünoblotlama - reaksiyonun prensibi; ana adımlar; gerekli malzemeler; Sonuç nasıl dikkate alınır? reaksiyon faydaları. Radyoimmunoassay (RIA) - reaksiyonun ana aşamaları nelerdir; antikorlar veya antijenler ne ile etiketlenir, sonuç nasıl dikkate alınır? bağışıklık elektron mikroskobu- yöntemin ilkesi; ana adımlar; gerekli malzemeler; Antikorlar neyle etiketlenir? reaksiyonun sonucunun nasıl dikkate alındığı. İmmobilizasyon reaksiyonları - yöntemin prensibi, ayar tekniği, bileşenler, sonuçların muhasebeleştirilmesi.

Kendi kendine eğitim sürecinde gerçekleştirilecek görevler.

Bu konuda ele alınan reaksiyonlar için Bağışıklık Reaksiyonları tablosunu doldurun.

Bağışıklık reaksiyonları

Öğrencinin uygulamalı bir derste çalışması

RSC'nin 1. aşamasının formülasyonu ile hemen çalışmaya başlayın, ancak daha sonra bir not defterine yazın (aşağıya bakın).

1. İmmün hemoliz reaksiyonu. İmmün hemoliz reaksiyonunun bir gösterimini görüntüleyin, bir diyagram olarak çizin, deney ve kontrol tüplerinde sonucu açıklayın.

2. Kompleman bağlama reaksiyonu

a) RSC'yi tabloya göre sökün;

b) bir deftere RSC'yi bir tablo şeklinde ayarlamak için bir şema çizin;

c) RSK'nın ikinci aşamasını koyun (ilk aşama dersin başına konur);

d) RSK için gerekli teşhis hazırlıklarını sökün;

e) sonucu dikkate alın. Test serumunda spesifik antikorların varlığı hakkında bir sonuç formüle edin.

3. İmmünofloresan reaksiyonu. Tabloyu inceleyin, not defterinizdeki reaksiyonu ayarlamak için bir şema çizin; tanı serumlarına bakın; serumun ne içerdiğini, nasıl hazırlandığını, hangi reaksiyon için (doğrudan veya dolaylı RIF) kullanıldığını belirleyin. Bir floresan mikroskopta RIF'nin gösterim sonucuna bakın.

4. Enzim immün testi (ELISA). Defterinizde iki versiyonda bir reaksiyon şeması oluşturun: test materyalindeki bir antijenin tespiti için ve serumdaki antikorların tespiti için. HIV ve Hepatit B Teşhis Bileşen Kitini gözden geçirin Her bir bileşenin ne içerdiğini ve ne için kullanıldığını belirleyin.

5. İmmünoblotlama. Defterinizde reaksiyonun bir diyagramını yapın; demoya bakın - reaksiyonun sonucu.

6. Radyoimmunoassay (RIA). Reaksiyon şemasını defterinize çizin.

7. Bağışıklık elektron mikroskobu (IEM). Gösteriyi izleyin - reaksiyonun sonucu, defterinize bir reaksiyon şeması çizin, antijeni (virüs) ve oklarla etiketlenmiş antikorları belirtin.

İmmünoblotlama, elektroforez ve ELISA veya RIA kombinasyonuna dayanan oldukça hassas bir protein saptama yöntemidir. İmmünoblotlama şu şekilde kullanılır: teşhis yöntemi HIV enfeksiyonu vb.

Genel anlamda, immünoblotlama, kovalent bağlarla bağlandıkları katı bir destek membranına aktarılan proteinlerin bir karışımının analizi ve ardından immün algılama olarak anlaşılır.

Doğrudan bir substrat üzerinde (dot blot analizi) veya elektrofokus, disk elektroforezi veya iki boyutlu elektroforez (Western blot) ile ön fraksiyonlanmasından sonra bir protein karışımını analiz etmek mümkündür.

Patojen antijenleri poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılır, daha sonra jelden aktive edilmiş kağıda veya nitroselüloz membrana aktarılır ve ELISA ile geliştirilir.

Firmalar bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretirler. Bu şeritlere hastanın serumu uygulanır. . Daha sonra inkübasyondan sonra hasta, hastanın bağlanmamış antikorlarından yıkanır ve enzim ile işaretlenmiş insan immünoglobulinlerine karşı serum uygulanır. . Şerit üzerinde oluşan kompleks (antijen + hastanın antikoru + insan Ig'sine karşı antikor), enzimin etkisi altında renk değiştiren bir kromojenik substrat eklenerek saptanır.

Bu metodoloji, hedef klonlanmış genlerin ürünlerini ifade eden bakteri, faj veya virüs klonlarının seçimine de uygulanır.

Proteinlerin zara transferi ya pasif olarak ya da elektrotransfer aparatı kullanılarak gerçekleştirilir. Membrana protein transferinin etkinliği, proteinlerin moleküler ağırlığı, jelin gözenekliliği, transfer süresi ve kullanılan tampon solüsyonunun (trans tampon) bileşimi gibi birçok faktörden etkilenir.

Deneyin görevlerine ve koşullarına bağlı olarak, en iyi sonuçları veren transfer koşulları seçilir. Yaygın olarak kullanılan substratlar nitroselüloz, poliviniliden diflorür (PVDF) veya pozitif yüklü naylon membranlardır. Nitroselüloz, 1 cm2 başına 80-100 mikrograma kadar protein bağlayabilir.

Düşük moleküler ağırlıklı proteinler (20 kDa'dan daha az moleküler ağırlığa sahip) yıkamaların bir sonucu olarak kaybolabilir, bu da ilgili kısıtlama DNA fragmanlarının uzunlukları ile belirli genetik lokusların polimorfizminin ön incelemesini mümkün kılar.

Ek olarak, Southern hibridizasyonunu kullanarak, hedef genin, iç kısmında belirli bir kısıtlama enzimi tarafından bir hidroliz alanına sahip olup olmadığını bulmak kolaydır; bu, incelenen genomun bölgesini klonlamak için en uygun stratejiyi seçmenize olanak tanır.

Benzer bir şemaya göre, RNA molekülleri agaroz jelden bir nitroselüloz filtresine de aktarılabilir. Bu yöntem, Güney'de Güney soyadından beri Southern lekelemenin aksine Northern lekeleme olarak adlandırılmıştır. ingilizce dili"güney" anlamına gelir.

Protein jelinden filtrelere transfer buna göre Western blotlama olarak adlandırıldı. Trans tamponda etanol varsa, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi içinde denatüre edilmiş büyük proteinler (100 kDa'dan büyük) zara zayıf bir şekilde aktarılabilir. Alkol, proteinlerin SDS-poliakrilamid jelden transferini önemli ölçüde iyileştirir, ancak jeldeki gözenekleri daraltır, bu da büyük proteinlerin tutulmasına yol açar.

PVDF membranı, bağışıklık tespiti için optimize edilmiştir ve çok düşük seviyede spesifik olmayan bağlanma ile 160 µg/cm2'ye kadar spesifik olarak bağlı proteinleri tutabilir.

immünoblotlama

Bu zarın önemli bir özelliği, tekrarlanan kullanım olasılığıdır. Zeta-Probe naylon membranları, alkol yokluğunda SDS proteinlerini etkili bir şekilde bağlar ve bu bağlanma sonraki işlemlere dirençlidir. Düşük moleküler ağırlıklı proteinler de etkili bir şekilde tutulur. 1 cm2 başına yaklaşık 480 μg protein yüksek bağlama kapasitesi ile Zeta-Probe membranları, tahlil karışımlarında eser miktarda proteinin saptanmasına izin verir.

Antijen zar üzerinde hareketsiz hale getirildikten sonra, kalan bağlanma bölgeleri jelatin veya sığır serum albümini veya yağsız süt solüsyonları ile bloke edilir.

Daha sonra membran, test edilen antijene poliklonal veya monoklonal antikorların bir solüsyonunda inkübe edilir. Bağlanmamış antikorları yıkadıktan sonra, membran, alkalin fosfataz enzimlerinin (alkalin fosfataz, AP) veya yaban turpu peroksidazının (HRP) bir konjugatı olan sekonder antikorların bir solüsyonunda anti-tür antikorları (tavşan, fare veya keçi antikorları) ile inkübe edilir. insan immünoglobulinleri) veya immünoglobulinlerin Fc bölgesi için yüksek bir afiniteye sahip proteinler A (Staphylococcus aureus proteini) veya G (Streptococcus sp. proteini).

Oluşan immün komplekslerin tespiti kimyasal veya kemilüminesan yöntemle gerçekleştirilir. için substratlar Kimyasal reaksiyon alkalin fosfataz konjugatları kullanırken 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) veya tetrazolyum mavisi (NBT) kullanın ve yaban turpu peroksidaz konjugatları kullanırken 4-kloro-1-naftol ve hidrojen peroksit kullanın.

Enzimatik reaksiyonların bir sonucu olarak, antijen-antikor kompleksinin lokalizasyon bölgesinde zar üzerinde renkli bir bant veya nokta oluşur.

Bu yöntemin duyarlılığı, AP konjugatları kullanıldığında 100 pg protein ve HRP konjugatları kullanıldığında 100-500 pg'dir. İmmün komplekslerin kemilüminesan tespiti, 5 pg'den az antijen tespit edebilir. Bu yöntemin ilkesi, HRP'nin hidrojen peroksit ve siklik diasilhidrazinlüminol ile reaksiyona girdiğinde, ışığa duyarlı bir film üzerine kaydedilebilen 428 nm dalga boyunda ışık yayılmasıdır.

İmmünoblotlama reaksiyonu (RI), ELISA temelinde geliştirilmiştir. İmmünokimyasal analizlerin en spesifik ve hassas yöntemidir. İmmünoblotlama (İngiliz lekesinden - ıslanmak, lekelenmek) ELISA'yı elektroforez ile birleştirir. HIV'e karşı karmaşık antikorları değil, kendi yapısal proteinlerine (proteinler-p24, glikoproteinler-gp120, gp 41, vb.) karşı antikorları tespit etmek için kullanılır. HIV enfeksiyonunun teşhisi için uzman (doğrulayıcı) tepkilere bakın.

Reaksiyon birkaç aşamada gerçekleştirilir:

Virüs, bir poliakrilamid jelde elektroforeze tabi tutulan bileşenler - antijenler (p24, gp120, gp 41, vb.)

2. Jel bir nitroselüloz membran ile kaplanır ve antijen fraksiyonları elektroforez yoluyla ona aktarılır. Nitroselüloz, kurutma kağıdı gibi davranır. Membran şeritler (şeritler) halinde kesilir. Firmalar bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretirler.

İmmünoblotlama - ek bir dolaylı yöntem

Üzerine HIV antijenleri uygulanan şeritler, deneğin serumuna daldırılır ve daha sonra bağlanmamış materyalden yıkanır.

4. Stripler, peroksidaz etiketli antiglobulin serumu ile inkübe edilir ve yıkanır.

Bir substrat eklenir ve AG-AT kompleksinin lokalizasyon bölgesine karşılık gelen renkli fraksiyonların (noktaların) sayısı not edilir.

Şeridin belirli alanlarında şeritlerin varlığı, çalışılan serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular. Üç HIV antijeninden herhangi ikisine (p24, gp41 ve gp 120) karşılık gelen bantlar zar üzerinde görünürse, immünoblotlamanın sonucu pozitif olarak kabul edilir (Şekil 37).

ÇİZİMLER

KULLANILAN EDEBİYAT LİSTESİ

ana edebiyat

Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: tıp öğrencileri için bir ders kitabı. üniversiteler 2. baskı, düzeltildi. ve ek — 702 s. Ed. AA Vorobyov. M. : MİA, 2012.

2. Mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: laboratuvar çalışmaları için bir rehber: çalışma kılavuzu / (V.B. Sboychakov ve ark.); ed. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: hasta.

3. Tıbbi mikrobiyoloji, immünoloji ve viroloji [Elektronik kaynak]: bal için bir ders kitabı.

üniversiteler - 760 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petersburg: Spetslit, 2010.

4. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 ciltte / V. 1. - 448 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Medya, 2010. .

5. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 cilt halinde Cilt 2. - 480 s. Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Medya, 2010.

ek literatür

1. İmmünodiagnostik reaksiyonlar: öğretici/ derleyen: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtariyeva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusya Sağlık Bakanlığı GBOU VPO BSMU Yayınevi, 2016. - 86p.

2. Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bakterilerinin birlikte yetiştirilen varyasyonlarının patojenik potansiyelini belirleyen bazı özelliklerin özellikleri: bilimsel yayın / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 sn.

ana » İmmünoblot - nedir bu? Teşhiste immünoblot bulaşıcı hastalıklar

İmmünoblot - bu nedir? Bulaşıcı hastalıkların tanısında immünoblot

immünoblot nedir? Bu yaygın bir laboratuvar tanı yöntemidir. viral enfeksiyonlar kişi. HIV varlığını tespit etmenin en doğru ve güvenilir yollarından biridir.

Güvenilirlik için enzim-bağlı immünosorbent (elisa) testinden bile daha büyüktür. İmmünoblot sonuçları kesin ve kesin kabul edilir.Genel Bilgi

İmmünoblot - bu nedir? Bir kişiyi HIV pozitif olarak tanımak için, kan serumunda antikorların varlığını test etmek için bir laboratuvar testinden geçmelisiniz.

Western blot kesitleri yöntemine Western blot (western blot) da denir. Ek bir uzman yöntemi olarak insan viral enfeksiyonlarını tespit etmek için kullanılır. Bu, kandaki HIV antikorlarının varlığını belirlemenizi sağlayan bir laboratuvar testi olan ELISA'yı doğrulamak için gereklidir. İmmünoblot pozitif ELISA'yı tekrar kontrol edin.

En hassas, karmaşık ve pahalı olarak kabul edilir.

Hedef

immünoblot nedir? Bu, virüse karşı antikorların varlığı için kan serumunun laboratuvar testi yöntemidir.

Jeldeki ve nitroselüloz membranlardaki toplam viral proteinlerin özel çalışmaları sırasında.

İmmünoblotlama (hastaların serumlarında belirli patojen antijenlerine karşı antikorların tespiti)

Western blot bölümü prosedürü, HIV enfeksiyonunu belirlemek için tasarlanmıştır. Farklı aşamalar. İlk aşamada, kendisini oluşturan parçalardan saflaştırılan virüs, elektroforeze ve içerdiği antijenlere, moleküler ağırlığa bölünerek tabi tutulur.

İnsan immün yetmezlik virüsü, genetik bilgisine gömülü canlı hücrelerde çoğalır. Bu aşamada, enfekte olmuşsanız, kişi HIV virüsünün taşıyıcısı olur.

Bu hastalığın özelliği, uzun zamandır görünmüyor. Virüs lenfositleri yok eder, böylece kişinin bağışıklığı azalır ve vücut enfeksiyonlarla savaşamaz hale gelir.

HIV doğru ve zamanında tedavi edilirse, hasta olgun bir yaşa kadar yaşayacaktır. Tedavi eksikliği kaçınılmaz olarak ölüme yol açar. Enfeksiyon anından itibaren, ancak tedavi olmaksızın, maksimum süre on yıldan fazla değildir.

özellikler

İmmünoblot analizi, birinci ve ikinci tipteki HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan güvenilir bir yöntemdir.

Bir kişiye virüs bulaşırsa, iki hafta sonra tespit edilebilen antikorlar çok daha sonra tespit edilebilir. HIV'in bir özelliği, antikor miktarının hızla artması ve hastanın kanında kalmasıdır. Mevcut olsalar bile, hastalık iki veya daha fazla yıl boyunca kendini göstermeyebilir. ELISA yöntemi, hastalığın varlığını her zaman doğru bir şekilde göstermez ve enzim immünolojik testi pozitif bir sonuç gösterdiyse, PCR ve Western blot bölümlerinden sonuçların doğrulanmasını gerektirir.

Endikasyonları

Ne tür bir “immünoblot” zaten bulundu, ancak çalışmada hangisi tanıtılıyor?

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) immünoblotunun test edilmesinin nedeni, pozitif bir ELISA sonucu olacaktır. Ameliyat olmak üzere olan hastalarda enzime bağlı immünosorbent testinden geçmek gerekir. Ek olarak, hamileliği planlayan kadınların yanı sıra rastgele evlilik yapanların da bir analizini yapmalısınız. Elisa sonuçları şüpheli ise, HIV enfeksiyonu olan hastalara Western blot kesitleri verilir.

Aşağıdaki endişe verici semptomlar bir doktora görünmek için bir neden olabilir: hızlı kilo kaybı; halsizlik, işlev kaybı; üç hafta süren bağırsak bozukluğu (ishal); dehidratasyon; ateş; artış Lenf düğümleri vücutta; kandidiyazis, tüberküloz, pnömoni, toksoplazmoz gelişimi, uçuk alevlenmesi.

Hastanın almadan önce hazırlanmasına gerek yoktur. venöz kan.

Testten 8-10 saat önce yemek yemeyin. Kan bağışından önceki gün heyecan yaşamak için alkollü ve kahveli içecekler içilmesi, ağır fiziksel egzersizler yapılması önerilmez.

Analiz nerede yapılır?

HIV için nerede test yaptırabilirim?

Kentsel özel kliniklerde yapılan bir immünoblot analizi olan ELISA, bir gün içinde sonuç verir. Anında teşhis de mümkündür. Rusya Federasyonu mevzuatına göre kamu kurumlarında elisa tıbbi testleri ve Western blot bölümleri ücretsizdir.

Gebelerin bulaşıcı hastalıkları ile hastaneye yatış veya ameliyat gerektiren hastalarda zorunlu tarama Bu çalışma nasıl yapılıyor?

ELISA nasıl yapılır? İmmünoblot pozitif/negatif, elisa sonuçlarını onaylar veya reddeder. Prosedür oldukça basittir. Uzman venöz kan alır, zamanla beş dakikadan az sürer.

Numune alındıktan sonra enjeksiyon bölgesi dezenfekte edilmeli ve bir sıva ile kapatılmalıdır. Örnekleme aç karnına yapılır, bu nedenle işlemden sonra bir bar bitter çikolata veya tatlı bir sıcak içecek yemekten zarar gelmez.

Bir kamu sağlık kurumunda ücretsiz analiz için sevk almak için bir terapisti ziyaret etmelisiniz.

Genel olarak, immünoblot, örnekleme yoluyla diğer kan testlerinden farklı değildir. Araştırma metodolojisi basittir. Bir kişinin kanında bir virüs varsa, vücut onu yok etmek için antikorlar üretmeye başlar. Her virüs için birçok protein antijeni vardır. Bu antikorların saptanması, Western blot kesit alma yönteminin temelidir. Fiyat

Ne kadar analiz? İmmünoblot HIV, ucuz araştırma anlamına gelir.

Ortalama olarak, tarama immünoassay yöntemleri 500 ila 900 ruble arasında değişmektedir. Western blot bölümleri, maliyeti üç ila beş bin ruble arasında değişen bir çalışma kontrolüdür. Daha karmaşık yöntemler çok daha pahalıdır. Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) analizi için yaklaşık 12.000 ruble ödemeniz gerekecek.

Sonuçların yorumlanması

HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için en yaygın yöntemler enzim immünoassay ve immünoblottur.

İnsan immün yetmezlik virüsüne karşı serum antikorlarının belirlenmesi içindir. Enfeksiyon genellikle iki testle doğrulanır: tarama ve doğrulama. Sonuçların yorumlanması bir doktor tarafından yapılmalıdır, tedaviyi teşhis eder ve reçete eder. İmmünoblot pozitifse, bunun anlamı şudur: insan vücudu virüs.

Olumlu bir sonuç, kendi kendine tedavi için bir neden olmamalıdır, çünkü her hasta kendi hastalık tablosuna sahip olabilir.

Kalitatif analiz, tarama ve sertifikalandırmayı içerir. Hastada virüs yoksa sonuç “negatif”tir. Bu sertifika bulunduğunda ek tarama testleri yapılır. Taramayı onaylayan veya reddeden immünoblot analizi. Test şeritleri belirli bölgelerin koyulaşmasında (protein lokalizasyonu) belirirse, teşhis "HIV"dir.

Sonuçlar şüpheli ise, testler üç ay içinde gerçekleştirilir.

İnsan immün yetmezlik virüsü ile enfeksiyonu önlemek için, belirli kurallara uymanız mümkündür: gündelik cinsel temastan kaçının, temas sırasında prezervatif kullanın, uyuşturucu kullanmayın.

Hamile bir kadında hastalık tespit edilirse, ilgili doktorun tavsiyelerine uymak önemlidir, virüsün varlığına yönelik testleri unutmayınız.

Western Blotlama Nedir?

Çeşitli dokuların kompleks karışımlarında veya ekstraktlarında protein tanımlaması sıklıkla karşılaşılan problemlerden biridir. Spesifik antikorlar gibi bir araç kullanarak, incelenen proteini minimum zaman ve finansal maliyetlerle belirlemek mümkündür.

Western blot yönteminde, ilk aşamada, bir protein karışımı sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında elektroforez ile ayrılır, daha sonra elektroblotlama ile bir nitroselüloz membrana aktarılır.

Bu yöntemin özü, elektroforezden sonra jelin, filtre kağıdı katmanları arasına bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirilmesi gerçeğinde yatmaktadır. Bu şekilde bir araya getirilen "sandviç", protein-SDS komplekslerinin jel plakası boyunca hareket etmesi ve nitroselüloz zarının yüzeyinde (spesifik olmayan sorpsiyonun bir sonucu olarak) hareketsiz kalması için bir elektrik alanına yerleştirilir.

Protein-SDS kompleksinin nitroselüloz membrana bağlanmasında esas olarak elektrik kuvvetleri rol oynar ve bu etkileşim çok noktalıdır ve zar yüzeyinde proteinlerin "yayılmasına" yol açar. Böylece, elektrotransferden sonra, poliakrilamid jelde olduğu gibi düzenlenmiş proteinlerle nitroselüloz üzerindeki jelin bir kopyasını elde ederiz.

SDS - elektroforez, elektrotransfer ve jelden bir nitroselüloz membran üzerine proteinlerin emilmesinden sonra, böyle sert bir işlemden sonra protein için üçüncül bir yapının varlığından bahsetmek genellikle doğruysa, proteinin üçüncül yapısı büyük ölçüde değişir. . Bu nedenle, incelenen proteinin immünokimyasal tespiti için genellikle sadece protein molekülünün lineer bölgelerine özgü mono- veya poliklonal antikorlar kullanılır.

51. Enzim immün testi, immünoblotlama. Mekanizma, bileşenler, uygulama.

Konformasyonel epitoplara (veya alt-birimler arası temasları içeren sitelere) özgü antikorlar, genellikle Western blot yönteminde kullanım için uygun değildir.

Protein transferinden sonra, zar sırayla çalışılan proteine özgü antikorlarla ve daha sonra bir enzim (veya başka bir) etiketi ile konjuge edilmiş birincil antikorların Fc fragmanlarına özgü ikincil antikorlarla inkübe edilir (Şekil 1a).

1 A). Çalışılan antijene özgü birincil antikorların doğrudan etiketle konjuge edilmesi durumunda ikincil antikorlara gerek yoktur (Şekil 1 B). İncelenen protein lokalizasyonu bölgesinde oluşan immün kompleksler, bir kromojenik substrat yardımıyla (etiket tipine bağlı olarak) “belirginleşir”.

Yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü, çalışmada hangi antikorların kullanıldığına büyük ölçüde bağlıdır.

Kullanılan antikorlar, yalnızca incelenen proteine özgü benzersiz bir amino asit dizisine özgü olmalıdır. Aksi takdirde, antikorların birkaç protein molekülü ile etkileşimi (özellikle kaba protein ekstraktları durumunda) mümkündür ve bu da zar üzerinde birkaç renkli bandın ortaya çıkmasına neden olacaktır.

Bu durumda incelenen proteinin tanımlanması çoğu zaman güçtür, hatta imkansızdır.

Antikor seçerken akılda tutulması gereken ikinci önemli faktör afinitedir. Kullanılan antikorların afinitesi ne kadar yüksek olursa, protein bantlarının boyanması o kadar parlak ve net olursa yöntemin duyarlılığı da o kadar yüksek olur. Yüksek afiniteli antikorlar kullanıldığında 1 ng ve hatta daha yüksek hassasiyet elde edilebilir.

Membran bağlı antijen ve antikorların etkileşiminin sonucunu görselleştirmek için, belirli koşullar altında belirli bir sinyal verebilen ajanlarla konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılır.

Genellikle, reaksiyon ürünü bir renge sahip olan ve çözünmeyen bir çökelti şeklinde zar üzerinde çöken bir enzim (peroksidaz veya fosfataz) bu tür bir ajan olarak kullanılır.

Bu yöntemde floresan etiketlerin kullanılması da mümkündür.

Pirinç. 1. Çalışılan proteinin immünokimyasal boyama şeması: A - bir enzim etiketi ile konjuge edilmiş ikincil antikorların kullanılması; B - birincil antikor, doğrudan bir enzim etiketi ile konjuge edilir.

Protokol:

I. Jel ve membran hazırlama ve protein elektrotransferi

Elektroforezden sonra poliakrilamid jel, blot tamponu (25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol) içeren bir banyoya yerleştirildi.

Kasetin anoda bakacak kısmına, kurutma kaseti şeklinde kesilmiş ve kurutma tamponu ile nemlendirilmiş iki adet filtre kağıdı yerleştirilir. Daha sonra filtre kağıdının üzerine aynı tamponla önceden nemlendirilmiş bir nitroselüloz membran yerleştirilerek membran ile kağıt arasında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir.

Bundan sonra jel dikkatli bir şekilde membran üzerine yerleştirilmeli, yine jel ile membran arasında hava kabarcığı olmamasına özellikle dikkat edilmelidir. Sandviç, jelin yüzeyine yerleştirilen iki kat ıslak filtre kağıdı ile tamamlanır (Şekil 2). Elde edilen sandviç kasete sıkıştırılır ve membran anoda bakacak şekilde elektrotlar arasına yerleştirilir.

Pirinç. 2. Proteinlerin zara elektrotransferi şeması.

II. elektro transfer

Proteinlerin bir nitroselüloz membrana elektrotransferi, 25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol içeren bir tamponda, 100 V sabit voltajda 30-50 dakika süreyle gerçekleştirilir.

Elektrotransfer süresi, aktarılan proteinlerin boyutuna bağlıdır, protein ne kadar büyükse, elektrotransfer o kadar uzun sürer. Elektrotransport kalitesi ve protein bantlarının düzenlenmesi, nitroselüloz membranın %1'lik %0.3'lük Ponceau S çözeltisi ile boyanmasıyla değerlendirilir. asetik asit. İmmün boyamadan önce, proteine bağlı boyayı çıkarmak için membran hafif alkali sulu Tris solüsyonu ile birkaç kez yıkanmalıdır.

III. Nitroselüloz membran üzerinde immobilize proteinlerin immünokimyasal boyanması

Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için membran, PBST içinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sürekli karıştırılarak inkübe edilir (daha iyi bloke etmek için %10 yağsız süt tozu içeren bir PBST solüsyonu kullanılabilir).

Bloke edildikten sonra membran, 1-10 µg/ml spesifik antikorlar içeren PBST içinde sürekli karıştırılarak oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir.

Optimal antikor konsantrasyonu ampirik olarak seçilir ve antikorların antijen ile etkileşiminin afinitesine bağlıdır.

İnkübasyonun sonunda, zar 5 kez PBST ile yıkandı ve yaban turpu peroksidazı ile konjüge edilmiş bir ikincil antikor çözeltisine aktarıldı. Konjugenin seyreltilmesi genellikle üretici tarafından ambalaj üzerinde belirtilir veya araştırmacı tarafından ampirik olarak seçilir. Membranı bir sekonder antikor çözeltisi içinde sürekli karıştırarak 1 saat kuluçkaya yatırın.

İyice yıkandıktan sonra (en az 5-6 tampon değişikliği), PBST membranı, 10 ml 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6 içinde 3 mg diaminobenzidin (DAB) ve 10 µl %30 hidrojen peroksit içeren bir kromojenik substrat çözeltisine aktarılır. .

İnkübasyon, 5 ila 10 dakika karıştırılarak gerçekleştirilir. Substrat ile inkübasyonun sona ermesinden sonra, membran PBST ile yıkanmalı, filtre kağıdı ile blotlanarak kurutulmalı ve renkli olarak taranarak hemen elektronik bir kopyası alınmalıdır. Zar tamamen kurursa, boyanmış protein şeritleri kaybolur ve görüntü daha az parlak ve kontrastlı olur.

Not: DAB toksiktir ve potansiyel bir kanserojendir. Sadece lastik eldivenlerle çalışın!

WHO tavsiyesine göre, HIV enfeksiyonunun tanısında ELISA sonuçlarını doğrulaması gereken ek bir uzman yöntemi olarak immünoblotlama (western blot) kullanılır. Bu yöntem genellikle, daha karmaşık ve pahalı olmasına rağmen daha hassas ve spesifik olarak kabul edildiğinden, pozitif bir ELISA sonucunu iki kez kontrol etmek için kullanılır.

İmmünoblotlama, enzim immünoassay (ELISA) ile virüs proteinlerinin bir jel içinde ön elektroforetik ayrımı ve bunların bir nitroselüloz membrana transferini birleştirir. İmmünoblot prosedürü birkaç adımdan oluşur (Şekil 27). İlk olarak, önceden saflaştırılan ve kurucu bileşenlerine yok edilen HIV, elektroforeze tabi tutulurken, virüsü oluşturan tüm antijenler moleküler ağırlıkla ayrılır. Daha sonra, lekeleme yoluyla antijenler jelden bir nitroselüloz şeridine veya bir naylon filtreye aktarılır ve bu şeritler artık HIV'e özgü, gözle görülmeyen bir protein spektrumu içerir. Daha sonra test materyali (serum, hastanın plazması vb.) şeride uygulanır ve numunede spesifik antikorlar varsa, bunlara kesinlikle karşılık gelen antijen protein şeritlerine bağlanırlar. Daha sonraki manipülasyonların bir sonucu olarak (ELISA gibi), bu etkileşimin sonucu görselleştirilir - görünür hale getirilir. Şeridin belirli alanlarında şeritlerin varlığı, çalışılan serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular.

Rusya'da şu anda HIV enfeksiyonunun laboratuvar teşhisi için standart prosedür HIV antikorlarının tespitienzim immunoassay kullanarak ardından reaksiyondaki özgüllüklerinin doğrulanması bağışıklık lekelenmesi.

HIV antikorları, enfekte olanların %90-95'inde enfeksiyondan sonraki 3 ay içinde, %5-9'unda - enfeksiyon anından 6 ay sonra ve %0.5-1'inde - daha sonraki bir tarihte ortaya çıkar. Antikorların tespiti için en erken zaman, enfeksiyon anından itibaren 2 haftadır.

HIV'e karşı antikorların tespiti 2 adımı içerir. İlk aşamada HIV antijenlerine karşı toplam antikor spektrumunun tespiti, çeşitli testler kullanılarak gerçekleştirilir: enzim immünoassay, aglütinasyon, kombine, tarak, membran filtresi veya membran difüzyonu. ikinci aşamada immünoblotlama, virüsün tek tek proteinlerine karşı antikorları belirlemek için kullanılır. Çalışmada, yalnızca Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı tarafından kullanım iznine sahip test sistemlerinin kullanılmasına izin verilmektedir. Teşhis prosedürleri, yalnızca uygun testlerin kullanımına ilişkin onaylanmış talimatlara uygun olarak gerçekleştirilmelidir.

Kan örneklemesi Kübital damardan temiz, kuru bir test tüpüne 3-5 ml miktarında yapılır. Yeni doğanlardan kordon kanı alınabilir. Elde edilen materyalin (tam kan) oda sıcaklığında 12 saatten fazla, buzdolabında 4-8°C'de 1 günden fazla saklanması önerilmez. Yaklaşan hemoliz analiz sonuçlarını etkileyebilir. Serum, santrifüjleme yoluyla veya bir Pasteur pipeti veya cam çubukla test tüpünün duvarı boyunca kan izlenerek ayrılır. Ayrılan serum temiz (tercihen steril) bir test tüpüne, flakon veya plastik kaba aktarılır ve bu formda 4-8°C sıcaklıkta 7 güne kadar saklanabilir. Çalışırken, 5 Temmuz 1990 tarih ve 42-28 / 38-90 sayılı "AIDS teşhis laboratuvarlarında anti-salgın rejime ilişkin talimatlar" da verilen güvenlik kurallarına uymalısınız.

HIV'e karşı toplam antikorların belirlenmesi.

İlk pozitif sonucun alınması üzerine, analiz 2 kez daha yapılır (aynı serumla ve aynı test sisteminde). En az bir pozitif sonuç alınmışsa (üç ELISA testinden iki pozitif sonuç) serum referans laboratuvara gönderilir.

Referans laboratuvarda, birincil pozitif serumlar (yani, ilk test sisteminde iki pozitif sonuç verenler), doğrulama için seçilen ikinci (diğer) test sisteminde ELISA'da yeniden incelenir.

İkinci test sisteminde analizin pozitif bir sonucu alındığında, serum IS'de incelenmelidir.

İkinci test sisteminde negatif sonuç alınırsa üçüncü test sisteminde serum tekrar incelenir.

Hem ikinci hem de üçüncü test sistemlerinde negatif bir test sonucu elde edilirse, HIV'e karşı antikorların bulunmadığına dair bir sonuca varılır.

Üçüncü test sisteminde pozitif bir sonuç elde edildiğinde, serum ayrıca immün blotlamada analize gönderilir.

bağışıklık lekelenmesi.

Yöntemin prensibi, bir nitroselüloz zar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş virüsün belirli proteinlerine karşı antikorları tespit etmektir. HIV-1'in zarf proteinleri (env) yaygın olarak glikoproteinler ("gp" veya "gp") olarak adlandırılır ve moleküler ağırlıkları kilodalton (cd) olarak ifade edilir: 160 kd, 120 kd, 41 kd. HIV-2'de glikoproteinlerin ağırlığı 140 kd, 105 kd, 36 kd'dir. HIV-1'deki çekirdek proteinler (gag) (genellikle proteinler - "p" veya "r" olarak anılır) sırasıyla 55 kd, 24 kd, 17 kd ve HIV-2 -56 kd, 26 kd moleküler ağırlığa sahiptir. , 18kd. HIV-1 (pol) enzimlerinin moleküler ağırlığı 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd'dir.

İmmünoblotlama sonuçları pozitif, belirsiz ve negatif olarak yorumlanır.

pozitif(pozitif), 2 veya 3 HIV glikoproteinine karşı antikorların tespit edildiği örnekler olarak kabul edilir.

olumsuz(negatif), HIV'in herhangi bir antijenine (protein) karşı antikor tespit etmeyen serumlardır.

Bir HIV glikoproteinine ve/veya HIV proteinlerinden herhangi birine karşı antikorları saptayan numuneler kabul edilir. şüpheli(tanımsız veya yorumlanamaz).

HIV-1 antijenleri ile bağışıklık lekesinde çekirdek proteinlere (gag) karşı antikorlarla belirsiz bir sonuç elde edildiğinde, HIV-2 antijenleri ile bir test yapılır.

İmmün lekelemenin pozitif sonuçlarının alınması üzerine, test materyalinde HIV'e karşı antikorların varlığı hakkında bir sonuca varılır.

Negatif bir test sonucunun alınması üzerine, IB, HIV'e karşı antikor bulunmadığına dair bir karar verir.

Belirsiz bir sonuç alındıktan sonra (p24 antijeni tespit edilmediyse), 3 ay sonra HIV antikorları için tekrarlanan testler yapılır,

ve 3 ay sonra belirsiz sonuçları korurken. p24 antijeni tespit edilirse, ilk belirsiz sonucu aldıktan 2 hafta sonra ikinci bir inceleme yapılır.

İlk muayeneden 6 ay sonra tekrar belirsiz sonuçlar alınırsa ve hasta enfeksiyon için risk faktörleri ve HIV enfeksiyonunun klinik semptomları yoksa, sonuç yanlış pozitif olarak kabul edilir. (Epidemiyolojik ve klinik endikasyonlar varsa serolojik çalışmalar reçete edildiği şekilde tekrarlanır).

Rekombinant virüse özgü polipeptitler "HIV blot" kullanılarak immün lekeleme, viral proteinlerin kendilerini değil, rekombinant polipeptitleri - HIV antijenlerinin analoglarını ("Env1", "Gag1", "Anket", "Env2") kullanması bakımından farklılık gösterir. Rekombinant Env1 polipeptidi, HIV-1 gp120 ve gp41'e karşı antikorları, Gag1 polipeptidini p17 ve p24 antijenlerine, Po11 polipeptidini p51 antijenine, Env2 polipeptidini HIV-2 gp110 ve gp38 antijenlerine karşı doğrudan tespit eder. Serum, Env1 veya Env2 veya her iki Env (HIV tip 1 ve 2 ikili enfeksiyon) ile reaksiyona girerse pozitif olarak kabul edilir. Sadece Poll ve Gag ile bir reaksiyon belirsiz bir sonuç olarak kabul edilir, bu durumda takip, HIV lizatı kullanan klasik bir immünoblotun belirsiz sonuçları vakalarına benzer şekilde gerçekleştirilir.

HIV ile enfekte annelerden doğan çocuklarda HIV enfeksiyonunun serolojik tanısının özellikleri, yaşamın ilk 6-12 ayında hem enfekte hem de enfekte olmayan çocukların anne kaynaklı HIV'e karşı antikorlara sahip olmaları ve daha sonra kaybolabilmeleridir. Bir çocukta HIV enfeksiyonunun varlığını gösteren kriter, 18 aylık veya daha büyük yaşta HIV'e karşı antikorların saptanmasıdır. HIV bulaşmış bir anneden doğan 18 aylık bir çocukta HIV'e karşı antikorların olmaması, HIV enfeksiyonuna karşı bir kriterdir.

İMMUNOBLOT(batı lekesi) - HIV'e karşı antikorların varlığı için kan serumunun laboratuvar testi yöntemi; ELISA'dan daha doğru bir testtir ve ELISA sonuçlarını doğrulamak için kullanılır. ELISA - enzim immunoassay (ELISA) - laboratuvar araştırması kandaki HIV antikorlarının varlığını belirlemeye izin veren; HIV antikor testi.

İmmünoblotlama, enzim immünoassay (ELISA) ile virüs proteinlerinin bir jel içinde ön elektroforetik ayrımı ve bunların bir nitroselüloz membrana transferini birleştirir. İmmünoblot prosedürü birkaç aşamadan oluşur (). İlk olarak, önceden saflaştırılan ve kurucu bileşenlerine yok edilen HIV, elektroforeze tabi tutulurken, virüsü oluşturan tüm antijenler moleküler ağırlıkla ayrılır. Daha sonra, lekeleme yoluyla antijenler jelden bir nitroselüloz şeridine veya bir naylon filtreye aktarılır ve bu şeritler artık HIV'e özgü, gözle görülmeyen bir protein spektrumu içerir. Daha sonra test materyali (serum, hastanın plazması vb.) şeride uygulanır ve numunede spesifik antikorlar varsa, bunlara kesinlikle karşılık gelen antijen protein şeritlerine bağlanırlar. Daha sonraki manipülasyonların bir sonucu olarak (ELISA gibi), bu etkileşimin sonucu görselleştirilir - görünür hale getirilir. Şeridin belirli alanlarında şeritlerin varlığı, çalışılan serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular.

İmmünoblotlama en yaygın olarak HIV enfeksiyonu tanısını doğrulamak için kullanılır. WHO, HIV zarf proteinlerinden herhangi ikisine karşı antikorların immünoblotlama ile tespit edilmesi durumunda serayı pozitif olarak değerlendirir. Bu önerilere göre, zarf proteinlerinden (gp160, gp120, gp41) sadece biri ile diğer proteinlerle reaksiyonla birlikte veya reaksiyonsuz bir reaksiyon varsa, sonuç şüpheli kabul edilir ve bir kit kullanılarak ikinci bir çalışma önerilir. farklı seri veya başka bir şirketten. Bundan sonra sonuç şüpheli kalırsa, çalışmalara her 3 ayda bir devam edilir.

İmmünoblotlama için, ilk aşamada, kan serumunda bulunan proteinler, bir elektrik alanı (jel elektroforez yöntemi) kullanılarak moleküler ağırlıklarına ve yüklerine göre jel içinde ayrılır. Daha sonra jele bir nitroselüloz veya naylon membran uygulanır ve "ıslatılır" (bu lekelemedir). Bu, malzemenin jelden membrana tam transferini sağlayan özel bir bölmede gerçekleştirilir. Sonuç olarak, jel üzerinde bulunan protein düzenleme modeli, daha sonra kolaylıkla manipüle edilebilen zar (leke) üzerinde yeniden üretilir. İlk olarak, zar istenen antijene karşı antikorlarla muamele edilir ve bağlanmamış materyal yıkandıktan sonra, antikorlara spesifik olarak bağlanan radyoaktif olarak etiketlenmiş bir konjugat eklenir (ELISA'da olduğu gibi). Elde edilen antijen-antikor etiketli konjugat kompleksinin konumu, x-ışını filmi kullanılarak otoradyografi ile belirlenir. Tezahüründen sonra, kanda antijen olup olmadığı her şey netleşir.