Имуноблотинг ХИВ позитивен. Как се диагностицира СПИН чрез имуноблот за ХИВ Имуноблот - какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Комплектът реагент MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 е предназначен да потвърди откриването на антитела срещу индивидуални протеини (антигени) на HIV-1 и/или HIV-1 група O и/или HIV-2 в серум или плазма човешка кръвимуноблот метод.

Отличителни черти:

Комплектът реагенти "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" съдържа пречистени лизатни вирусни протеини на HIV 1 и пептид - HIV-2 gp36 антигенен детерминант;
Осигурява откриване на антитела срещу HIV-1, HIV-1 група O, HIV 2 на една лента;
Лесна процедура за подготовка и провеждане на анализи;
Вътрешен качествен контрол на реакцията*
Максималната скорост на анализа (3 часа);
Малък обем на тестовата проба - 20 µl;
Не изисква допълнително оборудване за изследване;
Качеството на комплекта е гарантирано от използването на руски и международни стандартни проби**

* Вътрешният контрол на качеството се осигурява от наличието на:

вътрешни контролни ленти, осигурява контрол на въвеждането на проба от серум или плазма;
контролен отрицателен серум (К-);
контролен положителен серум (К+), който позволява да се идентифицират лентите, открити върху лентата;
контролен слабо положителен серум (K + cl), който осигурява контрол на чувствителността на комплекта реактиви.

**Гаранция за качество:

Характеристиките на комплекта реагент MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 бяха определени чрез тестване на проби от произволна извадка от донори, пациенти с диагноза HIV инфекция, търговски панели за сероконверсия, стандартни панели и проби с „потенциално смущаващи“ компоненти.

Комплектът реагент не дава фалшиво положителни резултати при изследване на серуми от стандартния панел, които не съдържат антитела срещу HIV 1.2 и HIV-1 антиген ("Стандартен AT (-) HIV", № FSR 2007/00953 от 10/ 25/2007). Специфичност - 100%.

Диагностичната специфичност е определена чрез изследване на произволна извадка от 200 донори от различни кръвни центрове и клиники с предварително потвърдена липса на HIV-1, HIV-2 инфекция. Специфичността при изследването на произволна извадка от донори е 100%;

Специфичността на комплекта реагенти е определена при изследването на 250 проби, включително проби от серум или плазма, получени от бременни жени, хоспитализирани пациенти, пациенти с хепатит С и Е и проби с компоненти на „потенциално интерфериращо определяне“. При използване на комплекта MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 не са открити фалшиво положителни резултати за тези проби.

Диагностичната чувствителност се определя с помощта на:
- Boston Biomedica, Inc. HIV-1 панелни плазмени проби (WWRB 301) от различни региони, съдържащи различни HIV-1 подтипове: група M (подтипове A, B, C, D, E, F) и група O; чувствителността на комплекта реактиви е 100%;

Чувствителността на комплекта реагенти беше определена при изследване на международни панели за сероконверсия Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), кат. бр. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932, PRB 940

Комплектът от реагенти открива антитела срещу HIV-1 в серума на стандартен панел, съдържащ антитела срещу HIV-1 („Стандартен AT (+) HIV-1”, № FSR 2007/00953 от 25 октомври 2007 г.), открива антитела към HIV-2 в серумите на стандартния панел, съдържащ антитела срещу HIV-2 ("Стандарт AT (+) HIV-2", № FSR 2007/00953 от 25.10.2007 г.). Чувствителност - 100%.

Удостоверение за регистрация № FSR 2010/07958 от 13 юли 2011 г. (валидността не е ограничена)

Съединение:

Имуносорбент. Бели нитроцелулозни мембранни ленти с индивидуални HIV-1 протеини (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17), адсорбирани върху тях чрез метода на електротрансфер и нанесени върху лентата със синтетичен HIV-2 пептид, аналог на gp36 протеин и анти-IgG човешки (вътрешен контрол) - 18 бр.;
К- - контролен отрицателен серум. Човешки кръвен серум, който не съдържа антитела срещу HIV-1,2, HCV, HIV антиген, HBsAg, се инактивира чрез нагряване при 560C; прозрачна светложълта течност - 1 епруветка (0,08 ml). Съдържа консерванти: тимеросал и натриев азид;
K+ - контролен положителен серум. Човешки кръвен серум, съдържащ антитела срещу HIV-1,2 (титър не по-малко от 1:10000), несъдържащ HBsAg, HIV антиген, антитела срещу HCV, инактивирани чрез нагряване при 560C; прозрачна светложълта течност - 1 епруветка (0,08 ml) Съдържа консерванти: тимерозал и натриев азид;
K+sl - контролен слабо положителен серум. Човешки кръвен серум, съдържащ антитела срещу HIV-1,2 (титър не повече от 1:200), несъдържащ HBsAg, HIV антиген, антитела срещу HCV, инактивирани чрез нагряване при 560C; прозрачна светложълта течност - 1 епруветка (0,08 ml). Съдържа консерванти: тимеросал и натриев азид;
RROKk (x10) - разтвор за разреждане на проби и конюгат. Концентрат - Tris буфер, съдържащ предварително обработен нормален кози серум; непрозрачна сива течност - 1 флакон (10 ml). Съдържа консервант: тимеросал;
PRk (x20) - разтвор за измиване. Концентрат - Tris буфер, съдържащ Tween-20; бистра безцветна течност - 1 флакон (70 ml). Съдържа консервант: тимеросал;
Конюгат. Кози антитела към човешки IgG, конюгирани с алкална фосфатаза; бистра безцветна течност - 1 епруветка (0,06 ml);
Субстрат (оцветяващ разтвор). Разтвор на 5-бромо-4-флуоро-индолил-фосфат (BCIP) и нитрозин тетразолий (NBT); прозрачна светложълта течност - 1 флакон (50 ml);
Прах за имунно блотиране. Обезмаслено мляко на прах - аморфен бял или светложълт прах - 5 пакета х 1гр.;
Таблетка с капак за настройка на реакция - 2 броя;
Пластмасови пинсети - 1 бр.

Имуноблотинг -(от английски "blot" - петно) - метод за идентифициране на антигени (или антитела) с помощта на известни серуми (или антигени). Представлява комбинация от гел електрофореза с ELISA. Първоначално бактериалните клетки или вириони се унищожават с помощта на ултразвук, а след това всички антигени на вируса или бактериалните клетки се разделят чрез електрофореза и се получава търговски реагент върху специален нитроцелулозен филм. При настройване на имуноблотинг тестовият серум на пациента се нанася върху филма с известни антигени. След инкубиране и измиване на несвързани антитела, те преминават към ELISA - антисерум срещу човешки имуноглобулини, маркирани с ензим и хромогенен субстрат, който променя цвета си при взаимодействие с ензима, се нанася върху филма. При наличие на антиген-антитяло-антисерум към имуноглобулин-ензимни комплекси върху носителя се появяват цветни петна. Методът на имуноблотинг ви позволява отделно да откривате антитела към различни антигени на патогена (например при HIV инфекция имуноблотингът открива антитела срещу gp120, gp24 и други антигени на вируса).

Радиоимуноанализ (RIA)

Методът се основава на реакцията антиген-антитяло, като се използва етикет на антиген или антитяло с радионуклид. 125I, 14C, 3H, 51Cr и други радионуклиди се използват като етикет. Получените имунни комплекси се изолират от системата и тяхната радиоактивност се определя на броячи (β-лъчение). Интензитетът на радиацията е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърдофазовата версия на RIA, използваща маркирани антитела или антигени, адсорбирани в ямките на полистиролови панели, се използва широко.

RIA се използва за откриване на антигени на микроби, вируси, различни хормони, ензими, лекарствени вещества, имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в изследвания материал в минимални концентрации от 10-12-10-15 g/l.

тестови въпроси

Реакция на имунна бактериолиза: какъв вид е реакцията; какво е антиген, какво е антитяло, механизъм на реакцията, методи на настройка, практическо приложение. Реакция на имунна хемолиза: необходими съставки, начин на поставяне; управление, практическо приложение. Реакция на локална хемолиза в гел (реакция на Yerne): принцип на реакцията, метод на формулиране, практическо приложение. Реакция на свързване на комплемента: принцип на реакцията; какво се образува, когато имунният серум взаимодейства със специфичен антиген; какво се случва с комплемента, ако той присъства в това взаимодействие? Каква е съдбата на комплемента, ако няма специфичен афинитет между антиген и антитела? Каква реакция може да се използва, за да се определи какво се е случило с комплемента; защо се използва тази реакция; какво е видимото положителен резултат RSK? Защо? Какво свойство на комплемента се използва в първата фаза на CSC? Във втората фаза? Ако крайният резултат от RSK е хемолиза, какво означава това - положителен или отрицателен резултат? Обяснете резултатите: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Назовете съставките на първата система RSK и съставките на втората система RSK. Защо тест серумът трябва да бъде инактивиран? Как се титрува комплементът? Хемолитичен серум: какво съдържа, как се получава, какво е титър и как се определя? Какви животни се използват за получаване на RSC компоненти? Техниката за поставяне на RSC на студено. При стадиране на коя от следните реакции е необходимо участието на комплемент: утаяване, флокулация, аглутинация, откриване на непълни антитела, имунна бактериолиза, имунна хемолиза, Jerne, CSC? Имунофлуоресцентна реакция (RIF) - посочва последователността на събитията в директната реакция на Coons; необходимите съставки. Какво е антиген, какво е антитяло, как се маркират антителата, как се отчита резултатът от реакцията, как изглежда положителният резултат? Практическо приложение - какво може да се определи с помощта на тази реакция? Непряка реакцияимунофлуоресценция - посочете последователността на събитията в тази реакция, необходимите съставки, какъв е антигенът, какви имунни серуми се използват; практическа употреба; предимство на индиректния RIF пред пряката реакция. Имуноензимен анализ (ELISA) - принцип на реакцията; необходими съставки; посочете последователността от събития при настройка на реакция за откриване на антиген в тестовия материал; необходими съставки; какво се случва с положителен резултат, как изглежда? Посочете последователността на действията по време на ELISA за откриване на антитела в тестовия серум; необходими съставки; какво се случва при положителен резултат? Имуноблотинг – принцип на реакцията; основни стъпки; необходими съставки; Как се отчита резултатът? ползи от реакцията. Радиоимуноанализ (РИА) - какви са основните етапи на реакцията; с какво са белязани антителата или антигените, как се взема предвид резултатът? Имуно електронна микроскопия– принципът на метода; основни стъпки; необходими съставки; С какво са маркирани антителата? как се отчита резултатът от реакцията. Реакции на имобилизация - принцип на метода, техника на настройка, компоненти, отчитане на резултатите.

Задачи за изпълнение в процеса на самоподготовка.

Попълнете таблицата с имунитетни реакции за реакциите, обхванати в тази тема.

Имунни реакции

Работа на студентите в практически урок

Започнете работа веднага с формулирането на 1-ва фаза на RSC, но го запишете в тетрадка по-късно (вижте по-долу).

1. Реакцията на имунна хемолиза. Вижте демонстрационна реакция на имунна хемолиза, начертайте я като диаграма, обяснете резултата в експерименталната и контролната епруветки.

2. Реакция на свързване на комплемента

а) разглобете RSC според таблицата;

б) начертайте в тетрадка схема за настройка на РСК под формата на таблица;

в) поставете втората фаза на RSK (първата фаза се поставя в началото на урока);

г) разглобява необходимите за РСК диагностични препарати;

д) вземете предвид резултата. Формулирайте заключение за наличието на специфични антитела в тестовия серум.

3. Реакция на имунофлуоресценция. Проучете таблицата, съставете схема за настройка на реакцията в тетрадката си; виж диагностични серуми; определя какво съдържа серумът, как се приготвя, за коя реакция (директна или индиректна RIF) се използва. Вижте демонстрационния резултат от RIF във флуоресцентен микроскоп.

4. Ензимен имуноанализ (ELISA). В тетрадката си съставете схема на реакция в два варианта: за откриване на антиген в тестовия материал и за откриване на антитела в серума. Прегледайте комплекта съставки за диагностика на ХИВ и хепатит B. Определете какво съдържа всяка съставка и за какво се използва.

5. Имуноблотинг. Направете схема на реакцията в тетрадката си; вижте демонстрацията - резултатът от реакцията.

6. Радиоимуноанализ (RIA). Начертайте схемата на реакцията в тетрадката си.

7. Имунна електронна микроскопия (IEM). Вижте демонстрацията - резултата от реакцията, съставете схема на реакцията в тетрадката си, посочете със стрелки антигена (вируса) и белязаните антитела.

Имуноблотингът е високочувствителен метод за откриване на протеин, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен методс HIV инфекция и др.

В общ смисъл имуноблотингът се разбира като анализ на смес от протеини, прехвърлени върху твърда поддържаща мембрана, с която те се свързват чрез ковалентни връзки, последвано от имунооткриване.

Възможно е да се анализира смес от протеини, директно отложени върху субстрат (дот блот анализ) или след нейното предварително фракциониране чрез електрофокусиране, дискова електрофореза или двуизмерна електрофореза (Western blotting).

Патогенните антигени се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел, след което се прехвърлят от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и се проявяват чрез ELISA.

Фирмите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. . След това, след инкубация, пациентът се измива от несвързани антитела на пациента и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензима. . Комплексът, образуван върху лентата (антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig) се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензима.

Тази методология се прилага и за селекция на клонове на бактерии, фаги или вируси, експресиращи продуктите на целевите клонирани гени.

Прехвърлянето на протеини към мембраната се извършва или пасивно, или с помощта на апарат за електротрансфер. Ефективността на преноса на протеин към мембраната се влияе от много фактори, като например молекулното тегло на протеините, порьозността на гела, времето за прехвърляне и състава на използвания буферен разтвор (транс буфер).

В зависимост от задачите и условията на експеримента се избират условия на трансфер, които дават най-добри резултати. Обикновено използваните субстрати са нитроцелулоза, поливинилиден дифлуорид (PVDF) или положително заредени найлонови мембрани. Нитроцелулозата може да свърже до 80-100 микрограма протеин на 1 cm2.

Протеините с ниско молекулно тегло (с молекулно тегло по-малко от 20 kDa) могат да бъдат загубени в резултат на измивания, което дава възможност за предварително изследване на полиморфизма на определени генетични локуси по дължините на съответните рестрикционни ДНК фрагменти.

Освен това, използвайки Южна хибридизация, е лесно да се разбере дали целевият ген има място на хидролиза от определен рестрикционен ензим във вътрешната си част, което ви позволява да изберете оптималната стратегия за клониране на областта на изследвания геном.

По подобна схема молекулите на РНК могат да се прехвърлят и от агарозен гел към нитроцелулозен филтър. Този метод е наречен Northern blotting за разлика от Southern blotting, тъй като фамилията Southern в английски езикозначава "южен".

Прехвърлянето към филтри от протеиновия гел съответно се нарича Western blotting. Големи протеини (по-големи от 100 kDa), денатурирани в разтвор на натриев додецилсулфат (SDS), могат да бъдат слабо прехвърлени към мембраната, ако етанолът присъства в транс буфера. Алкохолът значително подобрява преноса на протеини от SDS-полиакриламидния гел, но стеснява порите в гела, което води до задържане на големи протеини.

PVDF мембраната е оптимизирана за имунооткриване и е в състояние да задържа специфично свързани протеини до 160 µg/cm2 с много ниско ниво на неспецифично свързване.

Имуноблотинг

Важно свойство на тази мембрана е възможността за многократна употреба. Найлоновите мембрани Zeta-Probe ефективно свързват SDS протеини в отсъствието на алкохол и това свързване е устойчиво на последващо третиране. Протеините с ниско молекулно тегло също се задържат ефективно. С висок капацитет на свързване от приблизително 480 μg протеин на 1 cm2, Zeta-Probe мембраните позволяват откриването на следи от протеин в смесите за анализ.

След като антигенът е имобилизиран върху мембраната, останалите места на свързване се блокират с разтвори на желатин, говежди серумен албумин или обезмаслено мляко.

След това мембраната се инкубира в разтвор на поликлонални или моноклонални антитела към изследвания антиген. След измиване на несвързаните антитела, мембраната се инкубира в разтвор на вторични антитела, които са конюгат на ензими алкална фосфатаза (алкална фосфатаза, АР) или пероксидаза от хрян (HRP) с анти-видови антитела (кози антитела срещу заек, мишка или човешки имуноглобулини) или протеини А (протеин на Staphylococcus aureus) или G (протеин на Streptococcus sp.), имащи висок афинитет към Fc областта на имуноглобулините.

Откриването на образуваните имунни комплекси се извършва чрез химичен или хемилуминесцентен метод. Субстрати за химическа реакциякогато използвате конюгати на алкална фосфатаза, използвайте 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP) или тетразолиево синьо (NBT), а когато използвате конюгати на пероксидаза от хрян, използвайте 4-хлоро-1-нафтол и водороден пероксид.

В резултат на ензимни реакции върху мембраната се образува цветна лента или петно на мястото на локализиране на комплекса антиген-антитяло.

Чувствителността на този метод е 100 pg протеин при използване на AP конюгати и 100-500 pg при използване на HRP конюгати. Хемилуминесцентното откриване на имунни комплекси може да открие по-малко от 5 pg антиген. Принципът на този метод е, че когато HRP реагира с водороден пероксид и цикличен диацилхидразинлуминол, се излъчва светлина с дължина на вълната 428 nm, която може да бъде записана върху фоточувствителен филм.

Имуноблотинг реакцията (RI) е разработена на базата на ELISA. Това е най-специфичният и чувствителен метод за имунохимичен анализ. Имуноблотингът (от англ. blot - намокряне, петно) съчетава ELISA с електрофореза. Използва се за откриване не на сложни антитела срещу HIV, а на антитела към отделните му структурни протеини (протеини-p24, гликопротеини-gp120, gp 41 и др.). Обърнете се към експертни (потвърждаващи) реакции за диагностициране на HIV инфекция.

Реакцията протича на няколко етапа:

Вирусът се разрушава на компоненти - антигени (p24, gp120, gp 41 и др.), Които се подлагат на електрофореза в полиакриламиден гел, т.е. разделяне на антигени на фракции по молекулно тегло.

2. Гелът се покрива с нитроцелулозна мембрана и чрез електрофореза върху него се пренасят антигенни фракции. Нитроцелулозата се държи като попивателна хартия. Мембраната се нарязва на лентички (ленти). Фирмите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени.

Имуноблотинг - допълнителен индиректен метод

Лентите с приложени върху тях HIV антигени се потапят в серума на субекта и след това се измиват от несвързан материал.

4. Лентите се инкубират с белязан с пероксидаза антиглобулинов серум и се промиват.

Добавя се субстрат и се отбелязва броят на цветните фракции (петна), които съответстват на зоната на локализация на комплекса AG-AT.

Наличието на ивици в определени области на лентата потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени. Резултатът от имуноблотинга се счита за положителен, ако върху мембраната се виждат ивици, съответстващи на всеки два от трите HIV антигена - p24, gp41 и gp 120 (фиг. 37).

ЧЕРТЕЖИ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

Основна литература

Медицинска микробиология, вирусология и имунология: учебник за студенти по медицина. университети 2-ро изд., коригирано. и допълнителни — 702 стр. Изд. А.А. Воробьов. М. : MIA, 2012.

2. Микробиология, вирусология и имунология: ръководство за лабораторни изследвания: учебно ръководство / (V.B. Sboychakov et al.); изд. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – М.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 с.: ил.

3. Медицинска микробиология, имунология и вирусология [Електронен ресурс]: учебник за мед.

университети - 760 стр. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. Санкт Петербург: Спецслит, 2010.

4. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 тома / Т. 1. - 448 с. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М.: Geotar Media, 2010.

5. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. - 480 с. Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Geotar Media, 2010.

допълнителна литература

1. Имунодиагностични реакции: урок/ съставител: Г. К. Давлетшина, З. Г. Габидулин, А. А. Ахтариева, М. М.

Хуснаризанова, Ю. З. Габидулин, М. М. Алсинбаев - Уфа: Издателство на GBOU VPO BSMU на Министерството на здравеопазването на Русия, 2016. - 86с.

2. Характеристики на някои свойства, които определят патогенния потенциал на съвместно култивирани вариации на бактериите Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus: научна публикация / Ю. З. Габидулин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин - Уфа, 2015 г. - 250 с.

Начало » Имуноблот – какво е това? Имуноблот в диагностиката инфекциозни заболявания

Имуноблот - какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Какво е имуноблот? Това е общ лабораторен диагностичен метод. вирусни инфекциичовек. Това е един от най-точните и надеждни начини за откриване на наличието на ХИВ.

За надеждност той е дори по-голям от ензимно-свързания имуносорбентен (elisa) анализ. Резултатите от имуноблот се считат за окончателни и окончателни.Обща информация

Имуноблот - какво е това? За да разпознаете човек като ХИВ-позитивен, трябва да преминете лабораторен тест за наличие на антитела в кръвния серум.

Методът на Western blot срезове се нарича още Western blot (Western blot). Използва се за откриване на човешки вирусни инфекции, като допълнителен експертен метод. Това е необходимо за потвърждаване на ELISA - лабораторен тест, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV в кръвта. Повторна проверка на имуноблот положителен ELISA.

Счита се за най-чувствителния, сложен и скъп.

Цел

Какво е имуноблот? Този метод за лабораторно изследване на кръвен серум за наличие на антитела срещу вируса.

По време на специални изследвания на общите вирусни протеини в гела и върху нитроцелулозни мембрани.

Имуноблотинг (откриване на антитела в серума на пациенти срещу определени патогенни антигени)

Процедурата Western blot секция е предназначена за определяне на HIV инфекцията различни етапи. В първия етап пречистеният вирус от неговите съставни части се подлага на електрофореза и антигените, включени в него, се разделят на молекулното тегло.

Вирусът на човешката имунна недостатъчност се репликира в живи клетки, вградени в неговата генетична информация. На този етап човекът става носител на ХИВ вируса, ако сте били заразени.

Спецификата на това заболяване е, че то за дълго времене се появи. Вирусът унищожава лимфоцитите, поради което имунитетът на човек намалява и тялото става неспособно да се бори с инфекциите.

Ако ХИВ се лекува правилно и навременно, пациентът ще доживее до дълбока старост. Липсата на лечение неизбежно води до смърт. От момента на заразяване, но без лечение, максималният срок е не повече от десет години.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първи и втори тип.

Ако човек е заразен, след две седмици на антитела, които могат да бъдат открити много по-късно. Характеристика на ХИВ е, че количеството на антителата се увеличава бързо и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, заболяването може да не се прояви две или повече години. Методът ELISA не винаги точно показва наличието на заболяването, изисквайки потвърждение на резултатите от PCR и Western blot срезове, ако ензимният имуноанализ показа положителен резултат.

Показания за

Какъв вид „имуноблотинг“ вече е открит, но кой се въвежда в изследването?

Причината за тестване за имуноблот на вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) ще бъде положителен резултат от ELISA. Необходимо е да се премине през ензимно-свързан имуносорбентен анализ при пациенти, на които предстои операция. Освен това трябва да направите анализ на жените, които планират бременност, както и тези, които са безразборни. Western blot срезове се дават на пациенти с ХИВ инфекция, ако резултатите от ELISA са съмнителни.

Следните тревожни симптоми могат да бъдат причина да посетите лекар: бърза загуба на тегло; слабост, загуба на функция; разстройство на червата (диария), което продължава три седмици; дехидратация; треска; повишена лимфни възлив тялото; развитие на кандидоза, туберкулоза, пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Не е необходимо пациентът да се подготвя преди прием венозна кръв.

Не яжте 8-10 часа преди изследването. Не се препоръчва да пиете алкохол и кафе напитки, тежки физически упражнения, да изпитвате вълнение в деня преди кръводаряването.

Къде да направите анализа?

Къде мога да се изследвам за ХИВ?

ELISA, имуноблот анализ, извършен в градски частни клиники, дава резултати в рамките на един ден. Възможна е и незабавна диагностика. В обществените институции медицинските тестове ELISA и Western blot секциите са безплатни в съответствие със законодателството на Руската федерация.

Задължителен скрининг за инфекциозни заболявания на бременни жени и пациенти, които се нуждаят от хоспитализация или операция Как се провежда това изследване?

Как да проведем ELISA? Положителният/отрицателният имуноблот потвърждава или отхвърля резултатите от Елайза. Процедурата е доста проста. Специалистът взема венозна кръв, във времето отнема по-малко от пет минути.

След вземане на пробата мястото на инжектиране трябва да се дезинфекцира и да се залепи с пластир. Вземането на проби се извършва на празен стомах, така че след процедурата не боли да ядете блок черен шоколад или сладка топла напитка.

За да получите направление за безплатен анализ в обществена медицинска институция, трябва да посетите терапевт.

Като цяло, имуноблотът не се различава от другите кръвни тестове по вземане на проби. Методологията на изследването е проста. Ако в кръвта на човек има вирус, тялото започва да произвежда антитела, за да го унищожи. Има много протеинови антигени за всеки вирус. Откриването на тези антитела е в основата на метода за разделяне на Western blot. Цена

Колко анализ? Имуноблот ХИВ се отнася до евтини изследвания.

Средно методите за скрининг на имуноанализ варират от 500 до 900 рубли. Уестърн блот секциите са проверка на изследването, чиято цена варира от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR), ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Тълкуване на резултатите

Най-често срещаните методи за диагностициране на HIV инфекцията са ензимен имуноанализ и имуноблот.

Те са за определяне на серумни антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус. Инфекцията обикновено се потвърждава с два теста: скрининг и потвърждаващ. Тълкуването на резултатите трябва да се извършва от лекар, той диагностицира и предписва лечение. Ако имуноблотът е положителен, това означава, че човешкото тяловирус.

Положителният резултат не трябва да е причина за самолечение, тъй като всеки пациент може да има своя собствена картина на заболяването.

Качественият анализ включва скрининг и сертифициране. Ако пациентът няма вирус, резултатът е „отрицателен“. Когато този сертификат бъде открит, се извършват допълнителни скринингови тестове. Имуноблот анализ, който потвърждава или отхвърля скрининга. Ако тестовите ленти се появят в потъмняване на определени области (локализация на протеини), диагнозата е "ХИВ".

Ако резултатите са съмнителни, тогава тестовете се извършват в рамките на три месеца.

За да предотвратите инфекция с вируса на човешката имунна недостатъчност, е възможно, ако спазвате определени правила: избягвайте случаен сексуален контакт, използвайте презервативи по време на контакт, не използвайте наркотици.

Ако заболяването се открие при бременна жена, важно е да следвате препоръките на лекуващия лекар, не забравяйте за тестовете за наличие на вируса.

Какво е Western Blotting?

Идентифицирането на протеини в сложни смеси или екстракти от различни тъкани е един от често срещаните проблеми. Използвайки такъв инструмент като специфични антитела, е възможно да се определи изследваният протеин с минимални времеви и финансови разходи.

При Western blotting метода, на първия етап, смес от протеини се разделя чрез електрофореза в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS), след което се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електроблотинг.

Същността на този метод се състои в това, че гелът след електрофореза се поставя върху нитроцелулозна мембрана между слоевете филтърна хартия. Така сглобеният "сандвич" се поставя в електрическо поле, така че комплексите протеин-SDS да се движат през плочата на гела и да бъдат имобилизирани (в резултат на неспецифична сорбция) върху повърхността на нитроцелулозната мембрана.

При свързването на комплекса протеин-SDS с нитроцелулозната мембрана участват предимно електрически сили, като това взаимодействие е многоточково и води до "разпръскване" на протеините по повърхността на мембраната. Така след електротрансфер се получава реплика на гела върху нитроцелулоза с протеини, подредени по същия начин, както в полиакриламидния гел.

След SDS - електрофореза, електротрансфер и сорбция на протеини от гела върху нитроцелулозна мембрана, третичната конформация на протеина е силно променена, ако по принцип е правилно да се говори за съществуването на третична структура за протеина след такова грубо третиране . Следователно, за имунохимично откриване на изследвания протеин обикновено се използват само моно- или поликлонални антитела, специфични за линейните области на протеиновата молекула.

51. Имуноензимен анализ, имуноблотинг. Механизъм, компоненти, приложение.

Антителата, специфични за конформационни епитопи (или места, включващи контакти между субединици), обикновено не са подходящи за използване в Western blot метода.

След трансфер на протеин, мембраната се инкубира последователно с антитела, специфични за изследвания протеин, и след това с вторични антитела, специфични за Fc фрагментите на първичните антитела, конюгирани с ензимен (или някакъв друг) етикет (фиг.

1 А). В случай, че първичните антитела, специфични за изследвания антиген, са директно конюгирани с етикета, не са необходими вторични антитела (фиг. 1 B). Имунните комплекси, образувани на мястото на локализацията на изследвания протеин, се "проявяват" с помощта на хромогенен субстрат (в зависимост от вида на етикета).

Чувствителността и специфичността на метода силно зависи от това кои антитела се използват в изследването.

Използваните антитела трябва да са специфични за уникална аминокиселинна последователност, специфична само за изследвания протеин. В противен случай е възможно взаимодействие (особено в случай на груби протеинови екстракти) на антитела с няколко протеинови молекули, което от своя страна ще доведе до появата на няколко цветни ивици върху мембраната.

Идентифицирането на изследвания протеин в този случай често е трудно или дори невъзможно.

Вторият важен фактор, който трябва да имате предвид при избора на антитела, е афинитетът. Колкото по-висок е афинитетът на използваните антитела, толкова по-ярко и ясно се оцветяват протеиновите ленти, толкова по-висока е чувствителността на метода. При използване на антитела с висок афинитет може да се постигне чувствителност от 1 ng и дори по-висока.

За визуализиране на резултата от взаимодействието на мембранно свързания антиген и антителата се използват вторични антитела, конюгирани с агенти, способни да дадат определен сигнал при определени условия.

Обикновено като такъв агент се използва ензим (пероксидаза или фосфатаза), чийто реакционен продукт има цвят и се утаява върху мембраната под формата на неразтворима утайка.

Също така е възможно да се използват флуоресцентни етикети в този метод.

Ориз. 1. Схема на имунохимично оцветяване на изследвания протеин: А - използване на вторични антитела, конюгирани с ензимен маркер; B - първичното антитяло е директно конюгирано с ензимен етикет.

Протокол:

I. Приготвяне на гел и мембрана и протеинов електротрансфер

Полиакриламидният гел след електрофореза се поставя във вана с попиващ буфер (25 mM Tris, рН 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол).

Два листа филтърна хартия, изрязани по формата на попивателната касета и навлажнени с попивателен буфер, се поставят върху частта от касетата, която ще гледа към анода. След това върху филтърната хартия се поставя нитроцелулозна мембрана, предварително навлажнена със същия буфер, като се уверява, че няма въздушни мехурчета между мембраната и хартията.

След това гелът трябва внимателно да се постави върху мембраната, като отново се обръща специално внимание на липсата на въздушни мехурчета между гела и мембраната. Сандвичът се допълва от два слоя намокрена филтърна хартия, които се поставят върху повърхността на гела (фиг. 2). Полученият сандвич се захваща в касетата и се поставя между електродите, така че мембраната да гледа към анода.

Ориз. 2. Схема на електротрансфер на протеини към мембраната.

II. електротрансфер

Електротрансферът на протеини към нитроцелулозна мембрана се извършва в буфер, съдържащ 25 mM Tris, рН 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30–50 минути при постоянно напрежение от 100 V.

Времето за електротрансфер зависи от размера на прехвърлените протеини, колкото по-голям е протеинът, толкова по-дълго отнема електротрансферът. Качеството на електротранспорта и подреждането на протеиновите ленти се оценява чрез оцветяване на нитроцелулозната мембрана с 0,3% разтвор на Ponceau S в 1% оцетна киселина. Преди имунооцветяване, мембраната трябва да се измие няколко пъти с леко алкален воден разтвор на Tris, за да се отстрани свързаното с протеини багрило.

III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

За да се блокират местата за свързване на неспецифични антитела, мембраната се инкубира при постоянно разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути в PBST (за по-добро блокиране може да се използва разтвор на PBST, съдържащ 10% обезмаслено мляко на прах).

След блокиране, мембраната се инкубира за един час при стайна температура при постоянно разбъркване в PBST, съдържащ 1-10 μg/ml специфични антитела.

Оптималната концентрация на антитела се избира емпирично и зависи от афинитета на взаимодействието на антителата с антигена.

В края на инкубацията, мембраната се промива 5 пъти с PBST и се прехвърля в разтвор на вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. Разреждането на конюгата обикновено се посочва от производителя върху опаковката или се избира емпирично от изследователя. Инкубирайте мембраната в разтвор на вторични антитела за 1 час при непрекъснато разбъркване.

След щателно промиване (най-малко 5-6 промени на буфера), PBST мембраната се прехвърля в хромогенен субстратен разтвор, съдържащ 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 µl 30% водороден пероксид в 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 .

Инкубацията се извършва при разбъркване в продължение на 5 до 10 минути. След края на инкубацията със субстрата, мембраната трябва да се измие с PBST, да се изсуши чрез попиване с филтърна хартия и веднага да се направи електронно копие чрез сканиране в цвят. Ако мембраната изсъхне напълно, боядисаните протеинови ивици избледняват и изображението е по-малко ярко и контрастно.

Забележка: DAB е токсичен и потенциален канцероген. Работете само с гумени ръкавици!

Според препоръките на СЗО имуноблотингът (Western blot) се използва при диагностицирането на ХИВ инфекция като допълнителен експертен метод, който трябва да потвърди резултатите от ELISA. Този метод обикновено се използва за двойна проверка на положителен резултат от ELISA, тъй като се счита за по-чувствителен и специфичен, въпреки че е по-сложен и скъп.

Имуноблотингът комбинира ензимен имуноанализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им върху нитроцелулозна мембрана. Процедурата за имуноблот се състои от няколко стъпки (фиг. 27). Първо, предварително пречистен и унищожен до съставните си компоненти, ХИВ се подлага на електрофореза, докато всички антигени, които съставляват вируса, се разделят по молекулно тегло. След това, чрез попиване, антигените се прехвърлят от гела върху лента от нитроцелулоза или найлонов филтър, които сега съдържат спектър от протеини, които са характерни за ХИВ, невидими за окото. След това тестовият материал (серум, плазма на пациента и др.) се нанася върху лентата и ако има специфични антитела в пробата, те се свързват с лентите от антигенни протеини, които стриктно съответстват на тях. В резултат на последващи манипулации (като ELISA), резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. Наличието на ивици в определени области на лентата потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

В момента в Русия стандартната процедура за лабораторна диагностика на ХИВ инфекция е откриване на антитела срещу HIVс помощта на ензимен имуноанализпоследвано от потвърждение на тяхната специфичност в реакцията имунно блотиране.

Антителата срещу HIV се появяват при 90-95% от заразените в рамките на 3 месеца след заразяването, при 5-9% - след 6 месеца от момента на заразяването и при 0,5-1% - на по-късна дата. Най-ранният срок за откриване на антитела е 2 седмици от момента на заразяването.

Откриването на антитела срещу HIV включва 2 етапа. На първия етапоткриването на общия спектър от антитела срещу HIV антигени се извършва с помощта на различни тестове: ензимен имуноанализ, аглутинация, комбиниран, гребен, мембранен филтър или мембранно-дифузен. На втория етапимуноблотинг се използва за определяне на антитела към отделни протеини на вируса. В работата е допустимо да се използват само тестови системи, които имат разрешение за използване от Министерството на здравеопазването на Руската федерация. Диагностичните процедури трябва да се извършват само в съответствие с одобрените инструкции за използване на подходящите тестове.

Вземане на кръв се прави от кубиталната вена в чиста, суха епруветка в количество от 3-5 ml. Кръвта от пъпната връв може да бъде взета от новородени. Полученият материал (цяла кръв) не се препоръчва да се съхранява повече от 12 часа при стайна температура и повече от 1 ден в хладилник при 4-8°C. Предстоящата хемолиза може да повлияе на резултатите от анализа. Серумът се отделя чрез центрофугиране или чрез проследяване на кръвта по стената на епруветката с пастьорска пипета или стъклена пръчка. Отделеният серум се прехвърля в чиста (за предпочитане стерилна) епруветка, флакон или пластмасов контейнер и в този вид може да се съхранява до 7 дни при температура 4-8°C. При работа трябва да спазвате правилата за безопасност, посочени в "Инструкции за противоепидемичния режим в лабораториите за диагностика на СПИН" № 42-28 / 38-90 от 5 юли 1990 г.

Определяне на общите антитела срещу HIV.

След получаване на първия положителен резултат анализът се извършва още 2 пъти (със същия серум и в същата тест система). Ако е получен поне един положителен резултат (два положителни резултата от три ELISA теста), серумът се изпраща в референтната лаборатория.

В референтната лаборатория първичните положителни серуми (т.е. тези, които са дали два положителни резултата в първата тестова система) се изследват отново в ELISA във втората (друга) тестова система, избрана за потвърждение.

При получаване на положителен резултат от анализа във втората тест система, серумът трябва да се изследва в IS.

Ако при втората тестова система се получи отрицателен резултат, серумът се изследва отново в третата тестова система.

Ако се получи отрицателен резултат както при втората, така и при третата тестова система, се издава заключение за липсата на антитела срещу HIV.

Когато се получи положителен резултат при третата тестова система, серумът също се изпраща за анализ при имунно блотиране.

имунно блотиране.

Принципът на метода е да се открият антитела към определени протеини на вируса, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана. Протеините на обвивката (env) на HIV-1 обикновено се наричат гликопротеини ("gp" или "gp"), с молекулни тегла, изразени в килодалтони (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. В HIV-2 гликопротеините имат тегло 140 kd, 105 kd, 36 kd. Ядрените протеини (gag) (обикновено наричани протеини - "p" или "r") в HIV-1 имат молекулно тегло съответно 55 kd, 24 kd, 17 kd, а HIV-2 -56 kd, 26 kd , 18 кд. Ензимите HIV-1 (pol) имат молекулно тегло 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd.

Резултатите от имуноблотинга се интерпретират като положителни, неопределени и отрицателни.

положителен(положителни) се считат проби, в които се откриват антитела срещу 2 или 3 HIV гликопротеина.

отрицателен(отрицателни) са серуми, които не откриват антитела към нито един от антигените (протеините) на HIV.

Обмислят се проби, които откриват антитела срещу един HIV гликопротеин и/или който и да е от HIV протеините съмнително(недефиниран или неинтерпретируем).

Когато се получи неопределен резултат с антитела срещу основните протеини (gag) в имунния блот с HIV-1 антигени, се прави тест с HIV-2 антигени.

При получаване на положителни резултати от имунното блотиране се прави заключение за наличието на антитела срещу ХИВ в тестовия материал.

При получаване на отрицателен резултат от изследването МЗ издава заключение, че няма антитела срещу HIV.

При получаване на неопределен резултат (ако антигенът p24 не е открит), повторните тестове за антитела срещу HIV се извършват след 3 месеца,

и при запазване на неопределени резултати след още 3 месеца. Ако е открит антиген p24, второ изследване се извършва 2 седмици след получаване на първия неопределен резултат.

Ако 6 месеца след първия преглед отново се получат неопределени резултати и пациентът няма рискови фактори за инфекция и клинични симптоми на HIV инфекция, резултатът се счита за фалшиво положителен. (Ако има епидемиологични и клинични показания, серологичните изследвания се повтарят, както е предписано).

Имунен блотинг с помощта на рекомбинантни вирус-специфични полипептиди "HIV blot" се различава по това, че не използва самите вирусни протеини, а рекомбинантни полипептиди - аналози на HIV антигени ("Env1", "Gag1", "Poll", "Env2"). Рекомбинантният полипептид Env1 открива антитела директно към HIV-1 gp120 и gp41, полипептидът Gag1 към антигените p17 и p24, полипептидът Po11 към антигена p51, полипептидът Env2 към антигените gp110 и gp38 на HIV-2. Серумът се счита за положителен, ако реагира с Env1 или Env2 или и с двата Env (HIV тип 1 и 2 двойна инфекция). Реакция само с Poll и Gag се счита за неопределен резултат, в който случай проследяването се извършва подобно на случаите на неопределени резултати от класически имуноблот с използване на HIV лизат.

Особеностите на серологичната диагностика на ХИВ инфекцията при деца, родени от инфектирани с ХИВ майки, е, че както заразените, така и неинфектираните деца през първите 6-12 месеца от живота имат антитела срещу ХИВ от майчин произход, които след това могат да изчезнат. Критерият, показващ наличието на HIV инфекция при дете, е откриването на антитела срещу HIV на възраст от 18 месеца или повече. Липсата на антитела срещу HIV при 18-месечно дете, родено от майка, заразена с HIV, е критерий срещу HIV инфекция.

ИМУНОБЛОТ(Western blot) - метод за лабораторно изследване на кръвен серум за наличие на антитела срещу HIV; това е по-точен тест от ELISA и се използва за потвърждаване на резултатите от ELISA. ELISA - ензимен имуноанализ (ELISA) - лабораторни изследвания, което позволява да се определи наличието на HIV антитела в кръвта; Тест за ХИВ антитела.

Имуноблотингът комбинира ензимен имуноанализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им върху нитроцелулозна мембрана. Процедурата за имуноблот се състои от няколко етапа (). Първо, предварително пречистен и унищожен до съставните си компоненти, ХИВ се подлага на електрофореза, докато всички антигени, които съставляват вируса, се разделят по молекулно тегло. След това, чрез попиване, антигените се прехвърлят от гела върху лента от нитроцелулоза или найлонов филтър, които сега съдържат спектър от протеини, които са характерни за ХИВ, невидими за окото. След това тестовият материал (серум, плазма на пациента и др.) се нанася върху лентата и ако има специфични антитела в пробата, те се свързват с лентите от антигенни протеини, които стриктно съответстват на тях. В резултат на последващи манипулации (като ELISA), резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. Наличието на ивици в определени области на лентата потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

Имуноблотингът най-често се използва за потвърждаване на диагнозата HIV инфекция. СЗО счита серума за положителен, ако чрез имуноблотинг се открият антитела срещу всеки два от обвивните протеини на ХИВ. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41) в комбинация с или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен и се препоръчва второ изследване с помощта на комплект от различни серии или от друга фирма. Ако след това резултатът остане съмнителен, изследванията продължават на всеки 3 месеца.

За имуноблотинг, на първия етап, протеините, съдържащи се в кръвния серум, се разделят в гела според тяхното молекулно тегло и заряд с помощта на електрическо поле (метод на гел електрофореза). След това нитроцелулозна или найлонова мембрана се нанася върху гела и се "намокря" (това е попиване). Това се извършва в специална камера, която позволява пълно прехвърляне на материала от гела към мембраната. В резултат моделът на подреждане на протеини, който е върху гела, се възпроизвежда върху мембраната (петно), която след това може лесно да бъде манипулирана. Първоначално мембраната се третира с антитела към желания антиген и след измиване на несвързания материал се добавя радиоактивно белязан конюгат, който специфично се свързва с антителата (както при ELISA). Местоположението на получения конюгатен комплекс, белязан с антиген-антитяло, се определя чрез авторадиография, като се използва рентгенов филм. След проявата му всичко става ясно дали има антигени в кръвта или не.