Aglutinacijska reakcija na stekleni mikrobiologiji. Možnosti pospešenih reakcij aglutinacije. Reakcija pasivne hemaglutinacije in njene različice. Dešifriranje rezultatov testa na preprost način

Razširjena reakcija aglutinacije (RA). Za določitev AT v bolnikovem krvnem serumu dajte podaljšana reakcija aglutinacije (RA). Da bi to naredili, se nizu razredčin krvnega seruma doda diagnostik - suspenzija ubitih mikroorganizmov ali delcev z adsorbiranim Ag. Največja razredčitev aglutinacija Ag, imenovan titer krvnega seruma.

Različice aglutinacijske reakcije (RA) za odkrivanje AT - krvni test za tularemijo (z nanosom diagnostikuma na kapljico krvi in ​​pojavom vidnih belkastih aglutinatov) in Huddlesonovo reakcijo za brucelozo (z diagnostikom, obarvanim z encijanovo vijolico, naneseno na kapljico krvnega seruma).

Približna reakcija aglutinacije (RA)

Za identifikacijo izoliranih mikroorganizmov se na stekelca namesti približen RA. Da bi to naredili, kulturo patogena dodamo kapljici standardnega diagnostičnega antiseruma (v razredčitvi 1:10, 1:20). pri pozitiven rezultat izvedite podrobno reakcijo z naraščajočimi razredčinami antiseruma.

reakcijašteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčinah, ki so blizu titru diagnostičnega seruma.

OAS. Somatski O-Ag so toplotno stabilni in vzdržijo vrenje 2 uri, pri interakciji z AT tvorijo drobnozrnate agregate.

N-Ag. H-Ag (flagelat) termolabilen in hitro uničen pri 100 °C, pa tudi pod delovanjem etanola. Pri reakcijah s H-antiserumom po 2 urah inkubacije nastanejo ohlapni veliki kosmiči (tvorijo jih bakterije, ki se zlepijo z bički).

Vi Ar tifusna bakterija je relativno termostabilna (vzdrži temperaturo 60-62 ° C 2 uri); pri inkubaciji z Vi-antiserumom nastane drobnozrnat aglutinat.

Reakcije neposredne hemaglutinacije

Najenostavnejši od teh reakcije - aglutinacija eritrocitov ali hemaglutinacijo, ki se uporablja za določanje krvnih skupin v sistemu AB0. Za določitev aglutinacija(ali njegove odsotnosti) se uporabljajo standardni antiserumi z aglutinini anti-A in anti-B. Reakcija se imenuje neposredna, saj so proučevani antigeni naravne sestavine eritrocitov.

V skupni rabi z neposredna hemaglutinacija ima virusno hemaglutinacijo. Mnogi virusi so sposobni spontano aglutinirati eritrocite ptic in sesalcev, njihov dodatek v suspenzijo eritrocitov pa povzroči nastanek agregatov iz njih.

Reakcija aglutinacije

Aglutinacija (lat. aglutinacija- lepljenje) - lepljenje (povezava) korpuskularnih delcev, ki vsebujejo antigen (cele celice, delci lateksa itd.), z molekulami specifičnih protiteles v prisotnosti elektrolitov, ki se konča s tvorbo kosmičev ali usedline (aglutinata), vidnih s prostim očesom. Narava usedline je odvisna od narave antigena: bičkove bakterije dajejo usedlino velikih kosmičev, flagelarne in brez kapsule - drobnozrnate, kapsularne - nitaste. Razlikovati neposredno aglutinacijo, pri kateri interakcija s specifičnimi protitelesi neposredno vključuje lastne antigene bakterijske ali katere koli druge celice, na primer eritrocitov; in posredno ali pasivno, pri kateri bakterijske celice ali eritrociti ali delci lateksa niso nosilci lastnih, ampak tujih antigenov (ali protiteles), adsorbiranih na njih, da zaznajo protitelesa (ali antigene), ki so specifična zanje. Aglutinacijska reakcija vključuje predvsem protitelesa iz razredov IgG in IgM. Poteka v dveh fazah: najprej pride do specifične interakcije aktivnega središča protiteles z determinanto antigena, ta stopnja se lahko pojavi v odsotnosti elektrolitov in je ne spremljajo vidne spremembe v reakcijskem sistemu. Druga stopnja, tvorba aglutinata, zahteva prisotnost elektrolitov, ki zmanjšajo električni naboj kompleksov antigen + protitelo in pospešijo proces njihovega lepljenja. Ta faza se konča s tvorbo aglutinata.

Aglutinacijske reakcije postavimo na steklene ali gladke kartonske plošče ali v sterilne aglutinacijske epruvete. Aglutinacijske reakcije (direktne in pasivne) na steklu se običajno uporabljajo kot pospešena metoda za odkrivanje specifičnih protiteles v serumu bolnika (na primer pri brucelozi) ali za serološko identifikacijo povzročitelja. V slednjem primeru se običajno uporabljajo dobro prečiščeni (adsorbirani) diagnostični serumi, ki vsebujejo samo monoreceptorska protitelesa ali njihov nabor za različne antigene. Nedvomna prednost reakcije aglutinacije na steklu je preprostost njene formulacije in dejstvo, da traja nekaj minut ali celo sekund, saj se obe komponenti v njej uporabljata v koncentrirani obliki. Vendar ima le kvalitativno vrednost in je manj občutljiv kot epruveta. Razširjeni test aglutinacije v epruvetah daje natančnejše rezultate, saj vam omogoča, da določite kvantitativno vsebnost protiteles v serumu (nastavite njegov titer) in po potrebi registrirate dejstvo povečanja titra protiteles, ki je diagnostična vrednost. Za vzpostavitev reakcije se v aglutinacijo vnese serum, razredčen z 0,85% raztopino NaCl na določen način, in enako količino (običajno 0,5 ml) suspenzije standardnega diagnostika (ali testne kulture), ki vsebuje 1 milijardo bakterij v 1 ml. cevi. Obračunavanje rezultatov reakcije aglutinacije se izvede predhodno po 2 urah inkubacije epruvet pri temperaturi 37 ° C in končno po 20-24 urah glede na dva znaka: prisotnost in velikost oborine ter stopnjo prozornost supernatanta. Ocenjevanje poteka po sistemu štirih križcev. Reakcijo nujno spremlja kontrola seruma in antigena. V primerih, ko se za serološko identifikacijo povzročitelja uporablja natančen aglutinacijski test v epruveti, ima diagnostično vrednost, če je reakcija ocenjena kot pozitivna, ko je diagnostični serum razredčen z vsaj polovico svojega titra.

Upoštevati je treba, da pri mešanju raztopin homolognih antigenov in protiteles ni vedno opaziti vidnih manifestacij aglutinacijske reakcije. Oborina nastane le pri določenih optimalnih razmerjih obeh reakcijskih komponent. Izven teh meja, z znatnim presežkom antigena ali protiteles, reakcije ni opaziti. Ta pojav se imenuje "prozonski fenomen". Opazimo ga tako pri reakciji aglutinacije kot pri reakciji obarjanja. Pojav prozona v imunskih reakcijah je razložen z dejstvom, da so v njih vključeni antigeni praviloma polideterminantni in molekule protitelesa IgG imajo dva aktivna centra. Pri presežku protiteles se površina vsakega delca antigena prekrije z molekulami protiteles, tako da ne ostane nobena prosta determinantna skupina, zato drugo, nevezano aktivno središče protiteles ne more interagirati z drugim antigenskim delcem in ju povezati med seboj. Tvorbo vidnega aglutinata ali precipitata zavira tudi presežek antigena, ko ni niti enega prostega aktivnega mesta protiteles, zato se kompleksi antigen + protitelo + antigen ne morejo več povečevati.

Aglutinacija je aglutinacija in obarjanje mikrobov ali drugih celic pod delovanjem protiteles v prisotnosti elektrolita (izotonične raztopine natrijevega klorida). Skupine lepljivih bakterij (celic) imenujemo aglutinati. Za reakcijo aglutinacije so potrebne naslednje komponente:

1. Protitelesa (aglutinini), ki so v serumu bolne ali imune živali.

2. Antigen - suspenzija živih ali mrtvih mikrobov, eritrocitov ali drugih celic.

3. Izotonična (0,9%) raztopina natrijevega klorida.

Aglutinacijsko reakcijo za serodiagnozo uporabljamo pri tifusu in paratifusu (Vidalova reakcija), pri brucelozi (Wrightova in Huddlesonova reakcija), tularemiji itd. V tem primeru je bolnikov serum protitelo, znani mikrob pa antigen. Ko so mikrobi ali druge celice identificirani, njihova suspenzija služi kot antigen, znani imunski serum pa kot protitelo. Ta reakcija se pogosto uporablja za diagnosticiranje črevesne okužbe, oslovski kašelj itd.

Metode določanja stopnje RA

Približen RA na steklu

Razporejen RA

(volumetrična metoda)

Reakcija koaglutinacije

Razširjeni RA na steklu (seroidentifikacija)

Reakcija aglutinacije na steklu. Na stekelce brez maščobe nanesemo dve kapljici specifičnega (adsorbiranega) seruma in kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida. Neadsorbirane serume predhodno razredčimo v razmerju 1:5 - 1:100. Kapljice na steklo je treba nanesti tako, da je med njimi razdalja. Kulturo temeljito zdrgnemo z zanko ali pipeto na kozarec, nato dodamo kapljici izotonične raztopine natrijevega klorida in eni kapljici seruma, pri čemer vsako mešamo, dokler ne nastane homogena suspenzija. Serumska kapljica brez kulture je serumska kontrola.

Pozor! Kulture seruma ne smete prenesti v kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida, ki je kontrola antigena. Reakcija poteka pri sobni temperaturi 1–3 minute. Če kontrola seruma ostane prozorna, opazimo enakomerno motnost v kontroli antigena in kosmiči aglutinata se pojavijo na ozadju bistre tekočine v kapljici, kjer je kultura pomešana s serumom, se rezultat reakcije šteje za pozitiven.

Diagnostični fiziološki

serum + raztopina kulture + kultura

Razširjena reakcija aglutinacije (volumetrična metoda). Serumske razredčitve pripravljamo v zaporednih, največkrat dvakratnih razredčitvah. Metoda se imenuje bulk. Za določitev titra protiteles v krvnem serumu vzemite 6 epruvet. V prvo epruveto vlijemo 1 ml začetne razredčine seruma 1:50 in v vseh 6 epruvet z graduirano pipeto dodamo po 1 ml fiziološke raztopine. V prvi epruveti dobimo razredčino seruma 1:100 z volumnom 2 ml. Iz prve epruvete prenesite 1 ml v drugo epruveto, kjer postane razredčitev 1:200. Zato naredite vrsto serijskih razredčitev seruma v prvih 5 epruvetah (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Vlijte 1 ml iz pete epruvete v razkužilno raztopino. Dodajte 2 kapljici diagnostikuma v vseh 6 epruvet. Šesta epruveta je kontrolna kultura, saj vsebuje samo fiziološko raztopino in diagnostik.

Tak nadzor je potreben za izključitev spontane aglutinacije kulture. Epruvete pretresemo in za 2 uri postavimo v termostat pri temperaturi 37 °C, nato pustimo en dan pri sobni temperaturi, nato pa zabeležimo rezultate reakcije aglutinacije. Pri postavljanju aglutinacijske reakcije s serumi otrok v prvih mesecih življenja je zaradi funkcionalne inferiornosti tvorbe protiteles potrebno določiti nižje titre protiteles, kar se upošteva pri redčenju seruma. Začetno razredčitev seruma je 1:25. V prvi epruveti dobimo razredčino 1:50, nato 1:100 itd.

S pozitivnim rezultatom reakcije so v epruvetah na ozadju bistre tekočine vidne lepljive celice v obliki zrn ali kosmičev. Aglutinat se postopoma usede na dno v obliki »dežnika«, tekočina nad usedlino pa postane bistra. Antigenska kontrola je enakomerno motna.

Po naravi usedline ločimo drobnozrnato in grobo zrnato (kosmičem) aglutinacijo. Pri delu z O-serumi se doseže drobnozrnata aglutinacija. Grobozrnat - med interakcijo gibljivih mikrobov z flagelarnimi H-serumi. Prihaja hitreje kot drobnozrnat, nastala usedlina je zelo ohlapna in zlahka zlomljiva.

Intenzivnost reakcije je izražena na naslednji način:

Vse celice so se usedle, tekočina v epruveti je popolnoma prozorna. Rezultat reakcije je izrazito pozitiven;

Usedline je manj, popolne razsvetlitve tekočine ni. Rezultat reakcije je pozitiven;

Usedline je še manj, tekočina je bolj motna. Rezultat reakcije je dvomljiv;

na dnu epruvete je neznatna usedlina, tekočina je motna. Dvomljiv rezultat reakcije;

Sedimenta ni, tekočina je enakomerno motna, kot pri antigenski kontroli. Rezultat negativne reakcije

1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Zaradi svoje specifičnosti, enostavnosti nastavitve in dokazljivosti je reakcija aglutinacije postala razširjena v mikrobiološki praksi za diagnozo številnih nalezljivih bolezni.

Reakcija aglutinacije temelji na specifičnosti interakcije protiteles (aglutininov) s celimi mikrobnimi ali drugimi celicami (aglutinogeni). Zaradi te interakcije nastanejo delci – aglomerati, ki se oborijo (aglutinirajo) v obliki kosmičev.

V reakciji aglutinacije lahko sodelujejo tako žive kot mrtve bakterije, spirohete, glive, praživali, rikecije, pa tudi eritrociti in druge celice. Reakcija poteka v dveh fazah: prva (nevidna) specifična, povezava antigena in protiteles, druga (vidna) nespecifična, vezava antigenov, t.j. nastanek aglutinata.

Aglutinat nastane, ko se en aktivni center dvovalentnega protitelesa združi z determinantno skupino antigena. Reakcija aglutinacije, tako kot vsaka serološka reakcija, poteka v prisotnosti elektrolitov.

Zunanja manifestacija pozitivna reakcija aglutinacija je dvojna. Pri mikrobih brez bičanja, ki imajo samo somatski antigen O, se same mikrobne celice neposredno zlepijo skupaj. Takšna aglutinacija se imenuje drobnozrnata. Poteka v 18 22 urah. v

Bičkovi mikrobi imajo dva antigena, somatski O antigen in flagelarni H antigen. Če se celice zlepijo z bički, nastanejo veliki ohlapni kosmiči in takšno aglutinacijsko reakcijo imenujemo grobozrnata. Pride v 24 urah.

Aglutinacijsko reakcijo lahko nastavimo tako z namenom kvalitativnega in kvantitativnega določanja specifičnih protiteles v bolnikovem krvnem serumu kot z namenom določanja vrste izoliranega povzročitelja. v

Aglutinacijsko reakcijo je mogoče nastaviti tako v podrobni različici, ki omogoča delo s serumom, razredčenim na diagnostični titer, kot v različici nastavitve indikativne reakcije, ki načeloma omogoča odkrivanje specifičnih protiteles ali določanje vrste patogen.

Pri postavitvi natančne aglutinacijske reakcije za odkrivanje specifičnih protiteles v krvnem serumu preiskovanca odvzamemo testni serum v razredčini 1:50 ali 1:100. To je posledica dejstva, da so lahko v celem ali rahlo razredčenem serumu normalna protitelesa prisotna v zelo visokih koncentracijah, zato so lahko rezultati reakcije netočni. Testni material v tej različici reakcije je pacientova kri.

Kri se vzame na prazen želodec ali ne prej kot 6 ur po obroku (sicer so lahko v krvnem serumu kapljice maščobe, zaradi česar je moten in neprimeren za raziskave). Krvni serum bolnika običajno dobimo v drugem tednu bolezni, pri čemer sterilno odvzamemo 3-4 ml krvi iz kubitalne vene (v tem času se koncentrira največja količina specifičnih protiteles). Kot znani antigen se uporablja diagnostikum, pripravljen iz ubitih, a ne uničenih mikrobnih celic določene vrste s specifično antigensko strukturo.

Pri postavitvi podrobne reakcije aglutinacije za določitev vrste, vrste patogena je antigen živ patogen, izoliran iz testnega materiala. Znana so protitelesa, ki jih vsebuje imunski diagnostični serum. v

Imunski diagnostični serum je pridobljen iz krvi cepljenega kunca. Po določitvi titra (največje razredčitve, v kateri so odkrita protitelesa), diagnostični serum vlijemo v ampule z dodatkom konzervansa. Ta serum se uporablja za identifikacijo antigenske strukture izoliranega patogena.

MOŽNOSTI REAKCIJE AGLUTINACIJE

V teh reakcijah sodelujejo antigeni v obliki delcev (mikrobne celice, eritrociti in drugi korpuskularni antigeni), ki se zlepijo s protitelesi in se oborijo.

Za postavitev aglutinacijske reakcije (RA) so potrebne tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) protitelo (aglutinin) in 3) elektrolit (izotonična raztopina natrijevega klorida).

INDIKATIVNA (PLOŠČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Približno ali lamelno RA postavimo na predmetno stekelce pri sobni temperaturi. V ta namen na kozarec s Pasteurjevo pipeto ločeno nanesemo kapljico seruma v razredčitvi 1:10 1:20 in kontrolno kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida. Kolonije ali dnevna kultura bakterij (kapljica diagnostikuma) se vnesejo v obe bakteriološki zanki in temeljito premešajo. Reakcije se upoštevajo v nekaj minutah vizualno, včasih tudi s povečevalnim steklom (x5). S pozitivnim RA v kapljici s serumom opazimo pojav velikih in majhnih kosmičev, z negativnim pa serum ostane enakomerno moten.

REAKCIJA POSREDNE (PASIVNE) HEMAGLUTINACIJE (RNHA, RPHA)

Reakcija je nastavljena: 1) za odkrivanje polisaharidov, beljakovin, izvlečkov bakterij in drugih visoko dispergiranih snovi, rikecij in virusov, katerih kompleksov z aglutinini ni mogoče videti pri navadnem RA, ali 2) za odkrivanje protiteles v serumih bolnikov proti tem. visoko razpršene snovi in ​​najmanjši mikroorganizmi.

Pod posredno ali pasivno aglutinacijo razumemo reakcijo, pri kateri protitelesa medsebojno delujejo z antigeni, predhodno adsorbiranimi na inertnih delcih (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. Ali ovnovi eritrociti, I (0) človeške krvne skupine).

V reakciji pasivna hemaglutinacija(RPGA) se kot nosilec uporabljajo eritrociti. Z antigenom obremenjeni eritrociti se ob prisotnosti specifičnih protiteles proti temu antigenu zlepijo in precipitirajo. Antigensko senzibilizirane eritrocite uporabljamo v RPHA kot eritrocitni diagnostik za dokazovanje protiteles (serodiagnostika). Če so eritrociti obremenjeni s protitelesi (eritrocitni protitelesni diagnostikum), potem ga lahko uporabimo za dokazovanje antigenov.

Uprizoritev. V jamicah polistirenskih tablet pripravimo vrsto serijskih razredčin seruma. V predzadnjo vdolbinico dodamo 0,5 ml znanega pozitivnega seruma in v zadnjo vdolbinico 0,5 ml fiziološke raztopine (kontrole). Nato v vse vdolbinice dodamo 0,1 ml razredčenega eritrocitnega diagnostika, pretresemo in za 2 uri postavimo v termostat.

Računovodstvo. V pozitivnem primeru se eritrociti usedejo na dno jamice v obliki enakomerne plasti celic z zavihanim ali nazobčanim robom (obrnjen dežnik), v negativnem primeru pa v obliki gumba ali obročka. .

1.2. NEVTRALIZACIJSKA REAKCIJA. LIZA,
OPSONOFAGOCITNA REAKCIJA, PREOBČUTLJIVOSTNA REAKCIJA

REAKCIJA NEVTRALIZACIJE EKZOTOKSINA Z ANTITOKSINOM (RN)

Reakcija temelji na sposobnosti antitoksičnega seruma, da nevtralizira delovanje eksotoksina. Uporablja se za titracijo antitoksičnih serumov in določanje eksotoksina.

Pri titriranju seruma dodamo določeno dozo ustreznega toksina v različne razredčine antitoksičnega seruma. Ob popolni nevtralizaciji antigena in odsotnosti neuporabljenih protiteles pride do začetne flokulacije. Reakcija flokulacije se lahko uporablja ne le za titracijo seruma (na primer davice), temveč tudi za titracijo toksina in toksoida. Reakcija nevtralizacije toksina z antitoksinom je zelo praktičnega pomena kot metoda za določanje aktivnosti antitoksičnih terapevtskih serumov. Antigen v tej reakciji je pravi eksotoksin.

Jakost antitoksičnega seruma je določena z običajnimi enotami AE.

1 AU botulinskega seruma njegova količina nevtralizira 1000 DLM botulinskega toksina. Nevtralizacijsko reakcijo za določitev vrste ali vrste eksotoksina (pri diagnozi tetanusa, botulizma, davice itd.) Lahko izvedemo in vitro (po Ramonu) in pri določanju toksigenosti mikrobnih celic - v gelu ( po Ouchterlonyju).

Reakcija lize (RL)

Ena od zaščitnih lastnosti imunskega seruma je njegova sposobnost raztapljanja mikrobov ali celičnih elementov, ki vstopajo v telo.

Specifična protitelesa, ki povzročijo razpad (lizo) celic, imenujemo lizini. Glede na naravo antigena so lahko bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.

Lizini pokažejo svoj učinek le ob prisotnosti dodatnega faktorja - komplementa. Komplement kot dejavnik nespecifične humoralne imunosti najdemo v skoraj vseh telesnih tekočinah, razen v cerebrospinalna tekočina in tekočino v sprednjem prekatu. Dokaj visoko in konstantno vsebnost komplementa so opazili v serumu človeške krvi in ​​veliko v krvnem serumu morskih prašičkov. Pri drugih sesalcih je vsebnost komplementa v krvnem serumu drugačna.

Komplement je kompleksen sistem sirotkine beljakovine. Je nestabilen in se sesede pri 55 stopinjah 30 minut. Pri sobni temperaturi se komplement uniči v dveh urah. Zelo je občutljiv na dolgotrajno tresenje, na delovanje kislin in ultravijoličnih žarkov. Vendar pa je komplement dolgo (do šest mesecev) shranjen v posušenem stanju pri nizki temperaturi. Komplement spodbuja razgradnjo mikrobnih celic in eritrocitov.

Razlikovati reakcijo bakteriolize in hemolize.

Bistvo reakcije bakteriolize je, da ko se specifični imunski serum združi z njegovimi ustreznimi homolognimi živimi mikrobnimi celicami v prisotnosti komplementa, se mikrobi lizirajo.

Reakcija hemolize je sestavljena iz dejstva, da ko so eritrociti izpostavljeni specifičnemu, imunskemu serumu (hemolitiku) v prisotnosti komplementa, se eritrociti raztopijo, tj. hemoliza.

Reakcija hemolize v laboratorijski praksi se uporablja za določanje tyr komplementa, pa tudi za upoštevanje rezultatov diagnostičnih testov fiksacije komplementa. Titer komplementa je najmanjša količina, ki povzroči lizo rdečih krvničk v 30 minutah v hemolitičnem sistemu v volumnu 2,5 ml. Reakcija lize, tako kot vse serološke reakcije, poteka v prisotnosti elektrolita.

PREOBČUTLJIVOSTNE (ALERGIJSKE) REAKCIJE

Določene oblike antigena lahko ob večkratnem stiku s telesom povzročijo reakcijo, ki je v osnovi specifična, vendar vključuje nespecifične celične in molekularne dejavnike akutnega vnetnega odgovora. Poznamo dve obliki hiperreaktivnosti: preobčutljivost takojšnje vrste(GHT) in zapoznele preobčutljivosti (DTH). Prva vrsta reakcije se kaže s sodelovanjem protiteles, medtem ko se reakcija razvije najkasneje 2 uri po ponovnem stiku z alergenom. Druga vrsta se izvaja s pomočjo vnetnih T celic (Tr3) kot glavnih efektorjev reakcije, ki zagotavljajo kopičenje makrofagov v območju vnetja, reakcija se manifestira po 6-8 urah in kasneje.

Pred razvojem preobčutljivostne reakcije sledi srečanje z antigenom in pojav preobčutljivosti, tj. pojav protiteles, aktivno senzibiliziranih limfocitov in pasivno senzibiliziranih s citofilnimi protitelesi drugih levkocitov (makrofagov, granulocitov).

Preobčutljivostne reakcije imajo tri faze razvoja: imunološko; patokemija; patofiziološke.

V prvi, specifični fazi, alergen interagira s protitelesi in (ali) senzibiliziranimi celicami. V drugi fazi se iz aktiviranih celic sproščajo biološko aktivne snovi. Sproščeni mediatorji (histamin, serotonin, levkotrieni, bradikinin itd.) Povzročajo različne periferne učinke, značilne za ustrezno vrsto reakcije - tretja faza.

Preobčutljivostne reakcije četrtega tipa

Reakcije te vrste povzročajo patogene medcelične interakcije senzibiliziranih Thelperjev, citotoksičnih T-limfocitov (Tkillerjev) in aktiviranih celic mononuklearnega fagocitnega sistema, ki jih povzroča dolgotrajna stimulacija imunskega sistema z bakterijskimi antigeni, pri čemer pride do relativne insuficience imunskega sistema telesa. sistem za odstranjevanje bakterijskih povzročiteljev iz notranjega okolja nalezljivih bolezni. Te preobčutljivostne reakcije povzročajo tuberkulozne pljučne votline, njihovo kazeozno nekrozo in splošno zastrupitev pri bolnikih s tuberkulozo. Granulomatoza kože pri tuberkulozi in gobavosti je v morfopatogenetskem smislu v veliki meri sestavljena iz preobčutljivostnih reakcij četrtega tipa.

večina znan primer preobčutljivostne reakcije četrtega tipa je Mantouxova reakcija, ki se razvije na mestu intradermalnega dajanja tuberkulina bolniku, katerega telo in sistem sta občutljiva na antigene mikobakterij. Kot rezultat reakcije nastane gosta hiperemična papula z nekrozo v središču, ki se pojavi le nekaj ur kasneje (počasi) po intradermalnem dajanju tuberkulina. Tvorba papule se začne z izstopom iz žilne postelje v medcelične prostore mononuklearnih fagocitov cirkulirajoče krvi. Hkrati se začne emigracija polimorfonuklearnih celic iz žilnega korita. Nato se infiltracija nevtrofilcev zmanjša in začne infiltrat sestavljati pretežno limfociti in mononuklearni fagociti. To je razlika med Mantouxovo reakcijo in Arthusovo reakcijo, pri kateri se na mestu lezije kopičijo pretežno polimorfonuklearni levkociti.

Pri preobčutljivostnih reakcijah četrtega tipa dolgotrajna stimulacija senzibiliziranih limfocitov z antigeni povzroči patološke spremembe tkiva do patološko intenzivnega in podaljšanega sproščanja citokinov s strani Thelpers. Intenzivno sproščanje citokinov v lokusih poškodbe tkiva povzroči hiperaktivacijo celic sistema mononuklearnih fagocitov, ki se tam nahajajo, od katerih mnogi tvorijo verige epitelioidnih celic v hiperaktiviranem stanju, nekateri pa se združijo med seboj v celice velikanke. Makrofage, na površini katerih so izpostavljeni bakterijski in virusni antigeni, lahko uničimo z delovanjem Tkilerjev (naravnih ubijalcev).

Preobčutljivostno reakcijo četrtega tipa povzroči prepoznavanje tujega bakterijskega antigena s strani T-pomagačev, ki so senzibilizirani zanj. Nujen pogoj za prepoznavanje je interakcija induktorjev z antigeni, izpostavljenimi na površini celic, ki predstavljajo antigen, po endocitozi in obdelavi tujih imunogenov z mononuklearnimi fagociti. Še ena potreben pogoj izpostavljenost antigenom v kombinaciji z molekulami razreda I iz glavnega kompleksa tkivne združljivosti. Po prepoznavanju antigena senzibilizirani pomočniki sproščajo citokine in zlasti interlevkin2, ki aktivira naravne ubijalce in mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti sproščajo proteolitične encime in proste kisikove radikale, ki poškodujejo tkiva.

Kožnoalergični testi - testi za ugotavljanje preobčutljivosti telesa na alergene, za določitev njegove okužbe, na primer tuberkuloze, bruceloze, stopnje imunosti črede, na primer na tularemijo. Glede na mesto vnosa alergena ločimo: 1) kožne teste; 2) luščenje; 3) intradermalno; 4) podkožno. Klinična reakcija na alergen v kožno-alergijskem testu je razdeljena na lokalno, splošno in žariščno, pa tudi na takojšnjo in zapoznelo.

Lokalne reakcije mediatorskega tipa HIT se pojavijo po 5-20 minutah, izražene so kot eritem in mehur, izginejo po nekaj urah, ocenjujejo se s plus metodo po količini eritema, merjeno v mm. Lokalne reakcije HNZ se pojavijo po 24–48 urah, trajajo dolgo, kažejo se kot infiltrat, včasih z nekrozo v središču, in se ocenjujejo po velikosti infiltrata v mm, tudi po sistemu plus. Pri citotoksičnih in imunokompleksnih tipih GNT se hiperemija in infiltracija opazita po 3-4 urah, dosežeta največ pri 6-8 urah in izgineta po približno enem dnevu. Včasih opazimo kombinirane reakcije.

1.3. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (CFR)

Ta reakcija se uporablja za laboratorijske raziskave za odkrivanje protiteles v krvnem serumu pri različnih okužbah, pa tudi za identifikacijo povzročitelja po antigenski strukturi.

Test vezave komplementa je kompleksen serološki test, za katerega je značilna visoka občutljivost in specifičnost.

Značilnost te reakcije je, da se sprememba antigena med njegovo interakcijo s specifičnimi protitelesi pojavi le v prisotnosti komplementa. Komplement se adsorbira le na kompleks protitelo-antigen. Kompleks protitelo-antigen nastane le, če obstaja afiniteta med antigenom in protitelesom, prisotnim v serumu.

Adsorpcija komplementa na kompleksu "antigensko protitelo" lahko na različne načine vpliva na usodo antigena, odvisno od njegovih značilnosti.

Nekateri antigeni so v teh pogojih podvrženi ostrim morfološkim spremembam, vse do raztapljanja (hemoliza, Isaev-Pfeiferjev fenomen, citolitično delovanje). Drugi spremenijo hitrost gibanja (imobilizacija treponema). Spet drugi umrejo brez ostrega destruktivne spremembe(baktericidno ali citotoksično delovanje). Nazadnje, adsorpcije komplementa morda ne spremljajo zlahka opazne spremembe antigena.

Po mehanizmu RSC poteka v dveh fazah:

1. Prva faza je tvorba kompleksa "antigen protitelo" in adsorpcija na tem kompleksu komplementa. Rezultat faze ni vizualno viden (interakcija antigena in protiteles z obvezno udeležbo komplementa).
2. Druga faza je sprememba antigena pod vplivom specifičnih protiteles v prisotnosti komplementa. Rezultat faze je lahko vizualno viden ali neviden (detekcija rezultatov reakcije z indikatorskim hemolitičnim sistemom (ovčji eritrociti in hemolitični serum).

Uničenje eritrocitov s hemolitičnim serumom se pojavi le v primeru vezave komplementa na hemolitični sistem. Če je bil komplement predhodno adsorbiran na kompleksu antigen-protitelo, potem ne pride do hemolize eritrocitov.

Rezultat poskusa se oceni tako, da se ugotovi prisotnost ali odsotnost hemolize v vseh epruvetah. Reakcija se šteje za pozitivno s popolno zamudo hemolize, ko je tekočina v epruveti brezbarvna in se eritrociti usedejo na dno, negativna s popolno lizo eritrocitov, ko je tekočina intenzivno obarvana ("lak" kri). Stopnjo zakasnitve hemolize ocenimo glede na intenzivnost barve tekočine in količino sedimenta eritrocitov na dnu (++++, +++, ++, +).

V primeru, da spremembe v antigenu ostanejo nedostopne za vizualno opazovanje, je treba uporabiti drugi sistem, ki deluje kot indikator, ki vam omogoča oceno stanja komplementa in sklepanje o rezultatu reakcije.

Ta indikatorski sistem predstavljajo komponente reakcije hemolize, ki vključuje ovčje eritrocite in hemolitični serum, ki vsebuje specifična protitelesa proti eritrocitom (hemolizine), vendar ne vsebuje komplementa. Ta indikatorski sistem se doda epruvetam eno uro po nastavitvi glavnega CSC. Če je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, se tvori kompleks protitelo-antigen, ki adsorbira komplement nase. Ker se komplement uporablja v količini, ki je potrebna samo za eno reakcijo, in lahko pride do lize eritrocitov le v prisotnosti komplementa, potem ko se adsorbira na kompleksu "antigenskega protitelesa", ne bo prišlo do lize eritrocitov v hemolitičnem (indikatorskem) sistemu. . Če je reakcija fiksacije komplementa negativna, se kompleks "antigen protitelesa" ne tvori, komplement ostane prost, ob dodajanju hemolitičnega sistema pa pride do lize eritrocitov.

1.4. DNASONDE. VERIŽNA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR),
ENCIMSKA IMUNSKA METODA (ELISA), FLUORESCENTNA PROTITELESNA METODA (MFA)

METODE GENSKOGA SONDIRANJA

Intenziven razvoj molekularne biologije in ustvarjanje popolne metodološke osnove za genetske raziskave sta postala osnova genskega inženiringa. Na področju diagnostike je nastala in se hitro razvija smer določanja specifičnih nukleotidnih zaporedij DNK in RNK, tako imenovano gensko sondiranje. Takšne metode temeljijo na sposobnosti hibridizacije nukleinskih kislin, da tvorijo dvoverižne strukture zaradi interakcije komplementarnih nukleotidov (AT, GC).

Za določitev želenega zaporedja DNA (ali RNA) je posebej izdelana tako imenovana polinukleotidna sonda s specifičnim baznim zaporedjem. V njegovo sestavo je uvedena posebna oznaka, ki omogoča prepoznavanje nastanka kompleksa.

Čeprav genskega sondiranja ni mogoče pripisati metodam imunokemijske analize, se njegovo glavno načelo (interakcija komplementarnih struktur) metodično izvaja na enak način kot indikatorske metode imunodiagnostike. Poleg tega metode genskega sondiranja omogočajo izpolnjevanje informacij o povzročitelju okužbe v odsotnosti njegovega fenotipskega izražanja (virusi, vgrajeni v genom, "tihi" geni).

Za analizo DNK vzorec denaturiramo, da dobimo enoverižne strukture, s katerimi reagirajo molekule DNK ali RNKprobe. Za pripravo sond se uporabljajo bodisi različni deli DNA (ali RNA), izolirani iz naravnega vira (na primer enega ali drugega mikroorganizma), običajno predstavljeni kot genetske sekvence kot del vektorskih plazmidov, ali kemično sintetizirani oligonukleotidi. V nekaterih primerih se kot sonda uporabljajo pripravki genomske DNA, hidrolizirane na fragmente, včasih pripravki RNA, zlasti pogosto ribosomske RNA. Kot oznaka se uporabljajo isti indikatorji kot v različne vrste imunokemijska analiza: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (z nadaljnjo manifestacijo z avidinencimskim kompleksom) itd.

Vrstni red analize je določen z lastnostmi razpoložljive sonde

Trenutno se vedno bolj uporabljajo komercialni kompleti, ki vsebujejo vse potrebne sestavine.

Postopek analize lahko v večini primerov razdelimo na naslednje faze: priprava vzorca (vključno z ekstrakcijo in denaturacijo DNK), fiksacija vzorca na nosilec (najpogosteje polimerni membranski filter), predhibridizacija, sama hibridizacija, pranje nevezanih produktov, izpiranje vzorca, izpiranje vzorca, izpiranje vzorca. odkrivanje. Če ni standardnega pripravka sonde DNA ali RNA, jo najprej pridobimo in označimo.

Za pripravo vzorca bo morda treba "vzgojiti" testni material za identifikacijo posameznih bakterijskih kolonij ali povečati koncentracijo virusov v celični kulturi. Neposredna analiza vzorcev krvnega seruma, urina, oblikovani elementi krvi ali polne krvi za prisotnost povzročitelja okužbe. Za sprostitev nukleinskih kislin iz sestave celičnih struktur se celice lizirajo, v nekaterih primerih pa se pripravek DNK očisti s fenolom.

Med obdelavo z alkalijami pride do denaturacije DNA, to je njenega prehoda v enoverižno obliko. Vzorec nukleinske kisline se nato fiksira na nitrocelulozni ali najlonski membranski nosilec, običajno z inkubacijo od 10 minut do 4 ure pri 80 °C pod vakuumom. Nadalje se v procesu predhibridizacije doseže inaktivacija prostih vezavnih mest, da se zmanjša nespecifična interakcija sonde z membrano. Postopek hibridizacije traja od 2 do 20 ur, odvisno od koncentracije DNK v vzorcu, koncentracije uporabljene sonde in njene velikosti.

Ko je hibridizacija končana in se nevezani produkti izperejo, se zazna nastali kompleks. Če sonda vsebuje radioaktivno oznako, je membrana izpostavljena fotografskemu filmu, da se pokaže reakcija (avtoradiografija). Za druge oznake uporabite ustrezne postopke.

Najbolj obetavna je proizvodnja neradioaktivnih (ti hladnih) sond. Na isti osnovi se razvija tehnika hibridizacije, ki omogoča ugotavljanje prisotnosti patogena v preparatih rezov, punkcij tkiva, kar je še posebej pomembno pri patomorfološki analizi (hibridizacija in situ).

Bistven korak v razvoju metod sondiranja genov je bila uporaba reakcije pomnoževanja s polimerazo (PCR). Ta pristop omogoča povečanje koncentracije določenega (prej znanega) zaporedja DNK v vzorcu s sintezo več kopij in vitro. Za izvedbo reakcije dodamo encimski pripravek DNA polimeraze, presežek deoksinukleotidov za sintezo in tako imenovane primerje, dve vrsti oligonukleotidov iz 20-25 baz, ki ustrezajo terminalnim odsekom zaporedja DNA, ki nas zanima. Vzorec DNK v študiji. Eden od primerjev mora biti kopija začetka bralne regije kodirne verige DNK v smeri branja 53, drugi pa mora biti kopija nasprotnega konca nekodirajoče verige. Nato se z vsakim ciklom reakcije polimeraze število kopij DNK podvoji.

Za vezavo primerjev je potrebna denaturacija DNA (taljenje) pri 94 °C, čemur sledi segrevanje zmesi na 4055 °C.

Za izvedbo reakcije so bili programirljivi inkubatorji za mikrovzorce zasnovani tako, da enostavno spreminjajo temperaturne spremembe, ki so optimalne za vsako stopnjo reakcije.

Reakcija pomnoževanja lahko bistveno poveča občutljivost analize med sondiranjem genov, kar je še posebej pomembno pri nizkih koncentracijah povzročitelja okužbe.

Ena od pomembnih prednosti genskega sondiranja z ojačanjem je možnost preučevanja submikroskopske količine patološkega materiala.

Druga značilnost metode, pomembnejša za analizo kužnega materiala, je sposobnost odkrivanja skritih (tihih) genov. Metode, povezane z uporabo genskega sondiranja, bodo zagotovo vse bolj uveljavljene v prakso diagnosticiranja nalezljivih bolezni, saj bodo postajale enostavnejše in cenejše.

Metodi ELISA in RIF sta večinoma kvalitativni ali polkvantitativni. Pri zelo nizkih koncentracijah komponent nastajanja kompleksa antigen-protitelo ni mogoče registrirati niti vizualno niti s preprostimi instrumentalnimi sredstvi. Indikacija kompleksa antigena protitelesa se v takšnih primerih lahko izvede, če ena od začetnih komponent antigena ali protitelesa vnese oznako, ki jo je mogoče zlahka zaznati v koncentracijah, primerljivih s koncentracijo analita, ki ga je treba določiti.

Radioaktivni izotopi (na primer 125I), fluorescentne snovi in ​​encimi se lahko uporabljajo kot oznaka.

Glede na uporabljeno oznako obstajajo radioimunske (RIA), fluorescentne imunske (FIA), encimske imunske (ELISA) metode analize itd. Zadnja leta ELISA je dobila široko praktično uporabo, kar je povezano z možnostjo kvantitativnih določitev, visoko občutljivostjo, specifičnostjo in avtomatizacijo računovodstva.

Analizne metode ELISA skupina metod, ki omogočajo detekcijo antigenskega protitelesnega kompleksa z uporabo substrata, ki ga razcepi encim z videzom barve.

Bistvo metode je v kombinaciji komponent antigenske protitelesne reakcije z izmerjeno encimsko oznako. Antigen ali protitelo, ki reagira, je označeno z encimom. Po transformaciji substrata pod delovanjem encima lahko ocenimo količino komponente reakcije antigen-protitelo, ki je vstopila v interakcijo. Encim v ta primer služi kot marker imunskega odziva in vam omogoča vizualno ali instrumentalno opazovanje.

Encimi so zelo priročne oznake, ker jim njihove katalitične lastnosti omogočajo, da delujejo kot ojačevalci, saj lahko ena molekula encima proizvede več kot 1 x 105 molekul katalitičnega produkta na minuto. Treba je izbrati encim, ki dolgo časa ohranja svojo katalitično aktivnost, je ne izgubi pri vezavi na antigen ali protitelo in ima visoko specifičnost glede na substrat.

Glavne metode za pridobivanje protiteles ali antigenov, označenih z encimom, konjugati: kemijski, imunološki in genski inženiring. Za ELISA se najpogosteje uporabljajo encimi: hrenova peroksidaza, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Za odkrivanje aktivnosti encima v kompleksu antigen-protitelo z namenom vizualne in instrumentalne registracije reakcije se uporabljajo kromogeni substrati, katerih raztopine, sprva brezbarvne, med encimsko reakcijo pridobijo barvo, katere intenziteta je sorazmerna s količino encima. Tako se za ugotavljanje aktivnosti hrenove peroksidaze v trdni fazi ELISA uporablja kot substrat 5-aminosalicilna kislina, ki daje intenzivno rjavo barvo, ortofenilendiamin, ki tvori oranžno rumeno barvo. Za odkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze in galatozidaze se uporabljajo nitrofenilfosfati oziroma nitrofenilgalaktozidi.

Rezultat reakcije pri nastanku obarvanega produkta določimo vizualno ali s spektrofotometrom, ki meri absorpcijo svetlobe z določeno valovno dolžino.

Obstaja veliko možnosti za določanje ELISA. Obstajajo homogene in heterogene različice.

Glede na način nastavitve ločimo kompetitivne in nekompetitivne metode ELISA. Če je na prvi stopnji v sistemu prisotna samo analizirana spojina in njeni ustrezni vezavni centri (antigen in specifična protitelesa), potem je metoda nekompetitivna. Če sta na prvi stopnji prisotna analizirana spojina (antigen) in njen analog (encimsko označen antigen), ki med seboj tekmujeta za vezavo na specifične vezavne centre (protitelesa), ki so prisotna v pomanjkanju, potem je metoda konkurenčna. V tem primeru velja, da več kot testni antigen vsebuje raztopine, manjša je količina vezanih označenih antigenov.

METODA FLUORESCENTNIH PROTITELES (MFA) ali IMUNOFLUORESCENČNE REAKCIJE (RIF)

Imunofluorescentna metoda je metoda izbire za hitro detekcijo in identifikacijo neznanega mikroorganizma v testnem materialu.

Ag + AT + elektrolit = UV svetleči kompleks

Mikrobni serum, označen s fluorokromom

Barvilo fluorescein izotiocianat se pogosto uporablja FITC

V tej študiji se uporablja fluorescentni mikroskop.

RIF uprizoritev

Na bris nanesemo 30 µl raztopine protiteles, označenih s FITC.

Kozarec postavite v vlažno komoro in inkubirajte pri sobni temperaturi 20-25 minut ali v termostatu pri 37 °C 15 minut.

Kozarec spirajte v tekoči vodi iz pipe 2 minuti, sperite z destilirano vodo in posušite na zraku.

Na posušen razmaz nanesemo kapljico pritrdilne tekočine, razmaz pokrijemo s pokrovnim stekelcem in mikroskopiramo s fluorescenčnim mikroskopom ali fluorescenčnim nastavkom na običajnem optičnem mikroskopu.

Reakcija aglutinacije (iz lat. aglutinacija- bonding) - vezava telescev (bakterij, eritrocitov itd.) s protitelesi v prisotnosti elektrolitov.

Reakcija aglutinacije se manifestira v obliki kosmičev ali usedlin, sestavljenih iz teles (na primer bakterij), "zlepljenih" s protitelesi (slika 7.37). Reakcija aglutinacije se uporablja za: določitev patogena, izoliranega od bolnika; določanje protiteles v bolnikovem krvnem serumu; določanje krvnih skupin.

riž. 7.37 a, b. Aglutinacijska reakcija zIgM-protitelesa (a) inIgG- protitelesa (b)

1. Določitev patogena, izoliranega od bolnika. Približna reakcija aglutinacije na steklu (slika 7.38). V kapljico aglutinacijskega seruma dodamo suspenzijo bakterij, izoliranih od bolnika (razredčitev 1:20). Nastane kosmičasta oborina.

riž. 7.38.

Razširjena reakcija aglutinacije s patogenom, izoliranim od pacienta (slika 7.39). Razredčinam aglutinacijskega seruma dodamo suspenzijo bakterij, izoliranih od bolnika.

riž. 52

2. Določanje protiteles v bolnikovem krvnem serumu
Podaljšana aglutinacijska reakcija s pacientovim krvnim serumom (slika 7.39). Diagnostikum se doda razredčinam bolnikovega seruma.
- Aglutinacija z O-diagnosticumom (bakterije ubijejo s segrevanjem, ohranijo 0-antigen) poteka v obliki drobnozrnate aglutinacije.
- Aglutinacija s H-diagnosticumom (bakterije, uničene s formalinom, obdrži flagelarni H-antigen) je grobozrnata in poteka hitreje.
3. Aglutinacijski test za določanje krvnih skupin Aglutinacijsko reakcijo za določanje krvnih skupin uporabljamo za vzpostavitev sistema ABO (tabela b) z aglutinacijo eritrocitov z imunskimi serumskimi protitelesi proti antigenom krvnih skupin A (I), B (III). Kontrole so: serum, ki ne vsebuje protiteles, t.j. serumske krvne skupine AB (IV); antigeni, ki jih vsebujejo eritrociti skupin A (II), B (III). Negativna kontrola ne vsebuje antigenov, tj. uporabljeni so eritrociti skupine O (I).

Tabela 7.6. Določitev krvnih skupin ABO