استخدام WLHMS في تحليل المواد. مشاكل العلم والتعليم الحديثة. أمثلة على استخدام التحليل اللوني السائل بالاشتراك مع مقياس الطيف الكتلي الترادفي في المقايسات السريرية

الكلمات الدالة

حاشية. ملاحظة مقال علمي عن العلوم البيطرية ، مؤلف العمل العلمي - تشاخوفسكي بافيل أناتوليفيتش ، يانتسفيتش أليكسي فيكتوروفيتش ، دميتروشينكو أليسيا إيجوروفنا ، إيفانتشيك ألكسندر فيكتوروفيتش

تأثير العوامل البشرية له تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. فيما يتعلق بتأثيرها المعقد ، فإن تحديد الآثار السلبية للعوامل الفردية مهمة صعبة إلى حد ما. تم تطبيق منهجية التمثيل الغذائي ، التي تجعل من الممكن التغلب على هذه الصعوبات ، في تقييم طبيعة ودرجة تأثير النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب أثناء التحضير داخل الأنف مع النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس. واستهلاك يشرب الماءتم الحصول عليها من مصادر تقع في المنطقة المحتملة لإنتاج البوتاس. تم إجراء عزل الدهون من المصل باستخدام تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص المرحلة الصلبة ، مما يسمح بإزالة الكوليسترول من العينات. تم تحليل كل عينة بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS) ، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية الناتجة باستخدام طريقة المكونات الرئيسية (PCA) والتحليل العنقودي. تتيح التقنية المطورة إمكانية الفصل الفعال بين المستقلبات الكارهة للماء في مصل الدم. تم تحديد ملف الدهون في مصل الدم لحيوانات التجارب ، ولا سيما محتوى الفوسفوليبيدات والأوكسيستيرويدات ، وتم العثور على اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي بين حيوانات التجارب والحيوانات الضابطة. في مصل الدم لحيوانات التجارب تم زيادة تركيز المؤكسدات مقارنة بمجموعة التحكم.

مواضيع ذات صلة أوراق علمية في العلوم البيطرية ، مؤلف العمل العلمي - تشاخوفسكي بافيل أناتوليفيتش ، يانتسفيتش أليكسي فيكتوروفيتش ، دميتروشينكو أليسيا إيجوروفنا ، إيفانتشيك ألكسندر فيكتوروفيتش

• استجابة عضيات خلايا كبد الفئران لتأثير مجال مغناطيسي معدَّل بالسعة للتردد الصناعي

  2014 / بيلكين أناتولي دميترييفيتش ، ميشورينا سفيتلانا فيكتوروفنا

• التحديد الشامل الانتقائي للمستحضرات الهرمونية في اللحوم النيئة. تحليل ناهضات بيتا

  2016 / Kulikovsky A.V.، Kuznetsova O.A.، Ivankin A.N.

• استخدام الكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء لتقدير يوبيكوينون في الكائنات المائية

  2003 / Rybin V. G.

• تحديد N7 - ethyl] -guanine في بول الفئران كعلامة للتعرض لخردل الكبريت

  2017 / أورلوفا أولغا إيغوريفنا ، كاراكاشيف جورجي فاسيليفيتش ، شموراك فلاديمير إيغوريفيتش ، أبزيانيدز فيكتوريا فلاديميروفنا ، سافيليفا إيلينا إيغوريفنا

• تطوير طريقة HPLC-MS لتحليل حمض أورسوديوكسيكوليك في طريقة الكشف عن الأيونات موجبة الشحنة

  2013 / إيليا ألكساندروفيتش كراسنوف ، دي إي بوبكوف ، إم زايتسيفا ، إس إس بريسياش ، إن في كراسنوف

• تطوير التكنولوجيا لإنشاء جيل جديد من أنظمة الاختبار القائمة على الثرومبودفينسين للتشخيص السريع للأمراض المعدية والالتهابية

  2015 / إيفانوف يوري بوريسوفيتش ، فاسيلشينكو أليكسي سيرجيفيتش

• إجراء التحديد المتزامن لـ Carbamazepine و Carbamazepine-10،11-Epoxide بواسطة HPLC-MS / MS

  2015 / رودينا تي إيه ، ميلنيكوف إس ، سوكولوف إيه في ، بروكوفييف إيه بي ، أركييبوف في في ، أداموف جي في ، بوزدنياكوف دي إل ، أوليفير يو في.

• تكوين الأحماض الدهنية ومنشطات الزيوت النباتية

  2006 / Khasanov V.V. ، Ryzhova G. L. ، Dychko K. A. ، Kuryaeva T. T.

• تطوير والتحقق من صحة طريقة لتحديد جدازيبام في المواد البيولوجية عن طريق قياس الطيف الكروماتوما

  2015 / أ. تشوبينكو ، ماجستير سافتشينكو

• تحديد السيكلوسبورين أ في مصل الدم لمراقبة الأدوية العلاجية

  2008 / Fedorova G. A. ، Podolskaya E. P. ، Novikov A.V ، Lyutvinsky Ya. I. ، Krasnov N. V.

تحليل بروفيلات دهون المصل في خنازير غينيا للكشف المبكر عن التغيرات في الأيض تحت التعرض للملوثات البيئية

للتعرض للعوامل البشرية تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. نظرًا لتأثيرها المعقد ، يعد اكتشاف الآثار السلبية لبعض العوامل مهمة معقدة نوعًا ما. تم تطبيق منهجية التمثيل الغذائي التي تسمح بالتغلب على هذه الصعوبات في تقييم طبيعة ودرجة تأثير نفايات إنتاج أسمدة البوتاس على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب بعد التلقيح داخل الأنف بمخلفات إنتاج الأسمدة البوتاسية واستهلاك مياه الشرب التي يتم الحصول عليها من المصادر تقع في منطقة التأثير المحتمل لإنتاج الأسمدة البوتاسية. تم إجراء عزل الدهون من المصل بمساعدة تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص المرحلة الصلبة من العينات التي تسمح بإزالة الكوليسترين من العينات. تم إخضاع كل عينة لتحليل HPLC-MS ، وبعد ذلك تم معالجة المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة تحليل المكونات الرئيسية وتحليل الكتلة. تسمح التقنية المطورة بفصل المستقلبات الكارهة للماء في مصل الدم بكفاءة. كان هناك ملف تعريف دهون مصل ثابت لحيوانات التجارب ، ولا سيما محتوى الفوسفوليبيدات والأوكسيستيرويدات ، ووجدت اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي لحيوانات الاختبار والمراقبة. يتضح أنه في مصل حيوانات التجارب لوحظ زيادة تركيز هيدروكسيستيرويد بالمقارنة مع المجموعة الضابطة.

نص العمل العلمي حول موضوع "طريقة WLC-MS لتحليل ملامح الدهون في مصل الدم من خنازير غينيا لاكتشاف التغيرات المبكرة في التمثيل الغذائي عند التعرض للملوثات البيئية"

[الضبع والصرف الصحي 3/2014

Chakhovskiy P.A.1، Yantsevich A.V.2، Dmitrochenko A.E.2، Ivanchik A.V.2

طريقة HPLC-MS-MS لتحليل الملامح الدهنية لمصل الدم

خنازير غينيا لاكتشاف التغيرات الأيضية المبكرة عند تعرضها للملوثات بيئة

TU "المركز العلمي والعملي الجمهوري للصحة" ، 220012 ، مينسك ، جمهورية بيلاروسيا ؛ ^ معهد الكيمياء الحيوية العضوية التابع للأكاديمية الوطنية للعلوم في بيلاروسيا ، 220141 ، مينسك ، جمهورية بيلاروسيا

تأثير العوامل البشرية له تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. فيما يتعلق بتأثيرها المعقد ، فإن تحديد الآثار السلبية للعوامل الفردية مهمة صعبة إلى حد ما. تم تطبيق منهجية التمثيل الغذائي ، التي تجعل من الممكن التغلب على هذه الصعوبات ، لتقييم طبيعة ومدى تأثير النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب أثناء البذر داخل الأنف مع النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس واستهلاك مياه الشرب التي يتم الحصول عليها من مصادر تقع في منطقة إنتاج البوتاس المحتمل. تم إجراء عزل الدهون من المصل باستخدام تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص المرحلة الصلبة ، مما يسمح بإزالة الكوليسترول من العينات. تم تحليل كل عينة بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS) ، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية الناتجة باستخدام طريقة المكونات الرئيسية (PCA) والتحليل العنقودي. تتيح التقنية المطورة إمكانية الفصل الفعال بين المستقلبات الكارهة للماء في مصل الدم. تم تحديد ملف الدهون في مصل الدم لحيوانات التجارب ، ولا سيما محتوى الفوسفوليبيدات والأوكسيستيرويدات ، وتم العثور على اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي بين حيوانات التجارب والحيوانات الضابطة. في مصل الدم لحيوانات التجارب تم زيادة تركيز المؤكسدات مقارنة بمجموعة التحكم.

الكلمات الرئيسية: المنشطات. الدهون. مصل الدم؛ الملف الأيضي مخلفات صناعية.

P. A. Chakhovskiy1، A.V Yantsevich2، A. E.Dmitrochenko2، A. V. Ivanchik2 - تحليل ملامح شحمية المصل في خنازير غينيا للكشف المبكر عن التغيرات في الأيض تحت التعرض للملوثات البيئية

1 المركز العلمي والعملي الجمهوري للصحة ، مينسك ، جمهورية بيلاروسيا ، 220012 ؛ 2 معهد الكيمياء الحيوية العضوية ، مينسك ، جمهورية بيلاروسيا ، 220141

للمراسلات: Chakhovskiy Pavel Anatolyevich، [بريد إلكتروني محمي]. كوم

للتعرض للعوامل البشرية تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. نظرًا لتأثيرها المعقد ، يعد اكتشاف الآثار السلبية لبعض العوامل مهمة معقدة نوعًا ما. تم تطبيق منهجية التمثيل الغذائي التي تسمح بالتغلب على هذه الصعوبات في تقييم طبيعة ودرجة تأثير نفايات إنتاج أسمدة البوتاس على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب بعد التلقيح داخل الأنف بمخلفات إنتاج الأسمدة البوتاسية واستهلاك مياه الشرب التي تم الحصول عليها من المصادر الموجودة في منطقة التأثير المحتمل لإنتاج الأسمدة البوتاسية. تم إجراء عزل الدهون من المصل بمساعدة تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص المرحلة الصلبة من العينات التي تسمح بإزالة الكوليسترين من العينات. تم إخضاع كل عينة لتحليل HPLC -MS ، وبعد ذلك تم معالجة المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة تحليل المكون الرئيسي وتحليل الكتلة. تسمح التقنية المطورة بفصل المستقلبات الكارهة للماء في مصل الدم بكفاءة. كان هناك ملف تعريف دهون مصل ثابت لحيوانات التجارب ، ولا سيما محتوى الفوسفوليبيدات والأوكسيستيرويدات ، ووجدت اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي لحيوانات الاختبار والمراقبة. يتضح أنه في مصل حيوانات التجارب لوحظ زيادة تركيز هيدروكسيستيرويد بالمقارنة مع المجموعة الضابطة.

الكلمات المفتاحية: المنشطات ، الدهون ، مصل الدم ، التمثيل الغذائي ، النفايات الصناعية.

مقدمة

تتمثل إحدى أهم مهام بيولوجيا الأنظمة وعلم الوراثة الوظيفية في تكامل البروتينات وعلم النسخ والمعلومات حول عمليات التمثيل الغذائي التي تحدث في الجسم. ينعكس أي مرض أو عملية مرضية تحدث في الجسم في محتوى الأيضات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في الأنسجة والدم. في عام 1971 ، تم تقديم مصطلح "الملف الأيضي" للتوصيف المتكامل لمستقلبات بلازما الدم ذات الوزن الجزيئي المنخفض. نظرًا لأن التحليل المتزامن لعدة فئات من المستقلبات معقد للغاية وغير واقعي عمليًا ، يتم استخدام سلسلة من الطرق بشكل شائع لدراسة الملامح الأيضية ، بما في ذلك التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي عالي الدقة (NMR) وقياس الطيف الكتلي للكروماتو.

كقاعدة عامة ، تقتصر الدراسات الأيضية على مجموعة معينة من المواد منفصلة عن المكونات الأخرى أثناء تحضير العينة. بيانات المجموعة الناتجة أسهل في التفسير.

يمكن استخدام الملامح الأيضية (على وجه الخصوص ، البول وبلازما الدم) لتحديد طبيعة التغيرات الفسيولوجية الناتجة عن تناول المركبات السامة في الجسم. في كثير من الحالات ، يمكن أن توفر التغييرات الملحوظة توصيفًا إضافيًا لآفات معينة ، مثل الكبد والأنسجة الدهنية.

تحليل محتوى المنشطات والدهون في مصل الدم لديه إمكانات تشخيصية كبيرة. يميز تكوين الدهون في مصل الدم وهرمونات الستيرويد وسلائفها ومنتجاتها من التحولات الأيضية العديد من المعلمات الوظيفية للكائن الحي. تلعب هذه المواد دورًا تنسيقيًا مهمًا في تنظيم التمثيل الغذائي ووظيفة القلب والأوعية الدموية ، وتشارك في استجابة الجسم للإجهاد الحاد والمزمن.

يعد ملف الستيرويد معيارًا تشخيصيًا فريدًا لعدد من أمراض النساء والأورام المرتبطة بضعف تخليق واستقلاب هرمونات الستيرويد ، في حين لا يمكن تشخيص بعضها إلا من خلال ملف الستيرويد. في تحليل الملف الشخصي ، تعد إمكانية استخدام القيم المطلقة كمتغيرات بسيطة ومقارنتها مع المعيار أمرًا مهمًا للغاية. ومع ذلك ، قد يكون تغيير نسبة المقادير أكثر أهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر ملف تعريف الستيرويد معلومات عن عدد كبير من المنشطات في نفس الوقت.

تحديد ملف الستيرويد لمصل الدم - طريقة فعالةالكشف عن جميع اضطرابات استقلاب الستيرويد تقريبًا ، مما يسمح لك بوضعها

التشخيص الدقيق في العديد من الحالات السريرية ، على سبيل المثال ، في تضخم الغدة الكظرية الخلقي ، وفرط الألدوستيرونية من النوع الأول ، وفرط الألدوستيرونية الأولي ، ومرض إيتسينكو كوشينغ ، وقصور الغدة الكظرية ، وما إلى ذلك ، يعد ملف الستيرويد مهمًا في تشخيص اضطرابات التمايز الجنسي ووظيفة الجنس الغدد ، وكذلك قصور الغدة النخامية - الغدة الكظرية.

يؤدي الإفراط في تناول الملح ، وهو المكون السائد في نفايات سماد البوتاسيوم ، في جسم الفئران التجريبية ذات الوزن الزائد إلى التنشيط المفرط لتخليق الألدوستيرون ويسبب ارتفاع ضغط الدم وتلف الكلى مع متلازمة التمثيل الغذائي.

في مناطق الإنتاج الصناعي ذات درجة عالية من التلوث البيئي ، عادة ما يكون معدل حدوث السكان أعلى منه في المناطق "النظيفة" نسبيًا. كان الهدف من بحثنا هو مدينة سوليجورسك ، الواقعة في منطقة التعدين على نطاق واسع ومعالجة خامات البوتاس. في مناطق مقالب الملح ومخازن الحمأة لنباتات البوتاس ، تكونت منطقة تملح كلوريد الصوديوم ، والتي تغطي المياه الجوفية على عمق أكثر من 100 متر ، مما قد يؤثر على تلوث مصادر مياه الشرب والهواء الجوي.

لتقييم تأثير تلوث المكونات البيئية الفردية في منطقة الإنتاج الصناعي لأسمدة البوتاس ، قمنا بتحليل الملامح الدهنية لمصل الدم كمؤشر لاضطرابات التمثيل الغذائي المبكرة تحت تأثير خليط من المواد الكيميائية.

الهدف من العمل هو تحديد التغيرات الأيضية في حيوانات المختبر أثناء التعرض لمخلفات إنتاج البوتاس واستهلاك مياه الشرب التي يتم الحصول عليها من مصادر يحتمل أن تتأثر بنفايات الإنتاج باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS).

كان الهدف من الدراسة هو مصل الدم لحيوانات التجارب (خنازير غينيا) من المجموعة التجريبية والضابطة.

المواد والأساليب

أجريت الدراسات التجريبية على 35 خنزير غينيا (17 أنثى و 18 ذكور) بوزن 305-347 جرام.

[الضبع والصرف الصحي 3/2014

المجموعة التجريبية (بذور مع مخلفات الإنتاج الصناعي لأسمدة البوتاس و يشرب الماءمن نظام تزويد المياه في سوليجورسك) ، 20 فردًا (10 إناث و 10 ذكور) ؛

المجموعة الضابطة (التحضير بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر لإزالة آثار عامل الإجهاد الناتج عن إجراء التحضير) ، 15 فردًا (8 ذكور و 7 إناث).

أثناء التجربة ، تم عمل ملاحظات يومية من الحالة العامةالحيوانات والغذاء واستهلاك المياه.

لمحاكاة التعرض المزمن للاستنشاق (12 أسبوعًا) من نفايات إنتاج أسمدة البوتاس ، MU. No. 11-11-10-2002 "متطلبات تنظيم دراسات السمية والحساسية أثناء التنظيم الصحي للهباء الجوي المحتوي على البروتين في الهواء من منطقة العمل "، بما في ذلك تحديد جرعة البذور. تم طحن العينات من مقالب الملح في ملاط ​​رخامي إلى حالة مغبرة متجانسة ، مذابة في الماء المقطر للتركيز المطلوب ، مع مراعاة وزن جسم حيوانات التجارب (تمت مراقبة وزن الجسم أسبوعياً لضبط الجرعة). كانت الجرعات المحسوبة: في بداية التجربة - 2.028 مجم / 0.1 سم 3 ، بعد 4 أسابيع - 2.85 مجم / 0.1 سم 3 ، بعد 6 أسابيع - 3.17 مجم / 0.1 سم 3 ، بعد 8 أسابيع وحتى نهاية التجربة 3.8 مجم / 0.1 سم 3.

تم تثبيت خنزير غينيا بدون تخدير في وضع ضعيف مع رفع رأسه ، وتم حقن جرعة من المحلول الدافئ بالتناوب في فتحات الأنف (جزئيًا) (خلال 2-3 دقائق) باستخدام موزع ماصة بطريقة تمنع العطس. أكدت أصوات "السحق" الناتجة تغلغل المحلول في الجهاز التنفسي.

قامت مجموعة الحيوانات التجريبية "باستنشاق" الخليط يومياً مرة واحدة 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعاً. حيوانات المجموعة الضابطة "المستنشقة" بمحلول ملحي فسيولوجي (0.9٪ كلوريد الصوديوم).

لاختيار المواد البيولوجية ، تم تخدير الحيوانات (تخدير الأثير) ، بعد قطع الرأس ، تم جمع الدم. تم الحصول على المصل بالطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، وتم تخزينها عند -20 درجة مئوية لمزيد من الدراسات. تم تحليل الفسفوليبيدات والأوكسيستيرويدات والأحماض الدهنية في مصل الدم.

إعداد عينة. تمت إضافة معيار داخلي ، البروجسترون ، إلى مصل الدم حتى الوصول إلى تركيز 10-5 مولار (10 ميكرولتر لكل 1 مل من العينة). بعد ذلك ، لترسيب البروتينات الموجودة في العينة واستخلاص المنشطات ، تمت إضافة الميثانول إلى تركيز نهائي قدره 70٪ (2.33 مل من الميثانول لكل 1 مل من العينة) ، متبوعًا بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 10000 جم. شكلت البروتينات الموجودة في العينة راسبًا كثيفًا. تم فصل المادة الطافية من الحبيبات وتمريرها من خلال عمود استخلاص المرحلة الصلبة المشروطة مسبقًا (SPE) الذي يحتوي على 100 مجم من octadecylsilyl silica gel. تم تكييف عمود SFE عن طريق تمرير 2 مل بالتتابع من الميثانول و 2 مل من الماء و 2 مل من 70٪ من الميثانول. في المرحلة الأولى ، يرتبط الكوليسترول بالعمود ، والذي يكون محتواه في بلازما الدم والسوائل البيولوجية الأخرى مرتفعًا جدًا ، بالإضافة إلى عدد من الدهون الأخرى شديدة الكراهية للماء. بعد الارتباط بالكوليسترول ، تم غسل العمود مرة أخرى باستخدام 2 مل من 70٪ ميثانول. مع وجود نسبة عالية من الكوليسترول في العينة أو حجم كبير من العينة ، استخدم

يستخدم عمود TFE يحتوي على نسبة عالية من المواد الماصة. تم دمج الواتس وتبخيرها. تم إجراء التبخير عند 50 درجة مئوية في طائرة نفاثة غازية خاملة. تمت إذابة المتبقي الجاف في 500 ميكرولتر من ميثانول وطرده لمدة 10 دقائق عند 10000 جم. في هذه الحالة ، تترسب المركبات القطبية غير القابلة للذوبان الميثانول. تم فصل المادة الطافية عن المادة المترسبة وتم تخفيفها بالماء إلى تركيز ميثانول بنسبة 10٪. تم تمرير المحلول الناتج من خلال عمود TFE مُكيف مسبقًا (تم تمرير 2 مل من الميثانول ، 2 مل من الماء و 2 مل من 10٪ ميثانول) وغسلها باستخدام 2 مل من 10٪ ميثانول. تمت التصفية من المنشطات المرتبطة بالعمود باستخدام 3 مل من 80٪ ميثانول. يبخر المحلول ويذوب المتبقي الجاف في 100 ميكرولتر من الميثانول. تم تحليل الحل الناتج باستخدام HPLC-MS.

تحليل HPLC. تم إجراء التحليل على كروماتوجراف Accela المجهز بكاشف قياس الطيف الكتلي LCQ-Fleet. تم إجراء الفصل على عمود Cosmosil 5C18-MS-II بمعلمات هندسية 4.6 * 150 مم (Nacalai Tesque ، اليابان).

برنامج الفصل (المذيب أ - الماء ، المذيب ب - الميثانول ، معدل التدفق 500 ميكرولتر / دقيقة): لمدة 5 دقائق 60٪ ب ، 12 دقيقة - التدرج الخطي 60-95٪ ب ، 10 دقيقة - 95٪ ب ، 8 دقائق - خطي التدرج 95-100٪ ب ، 5 دقائق - 100٪ ب ، 5 دقائق - 60٪ ب.

لتحليل مقياس الطيف الكتلي ، تم استخدام مصدر التأين الكيميائي في الضغط الجوي(APCI). معلمات مصدر التأين: درجة حرارة المبخر - 350 درجة مئوية ، وتدفق غاز التجفيف - 35 وحدة ، وتدفق الغاز الإضافي - 5 وحدات ، ودرجة الحرارة الشعرية - 275 درجة مئوية ، والجهد الشعري - 18 فولت ، والجهد على هدف الأيونات - 80 فولت. البيانات المستخدمة- وضع المسح المعتمد (Data Dependent ™) باستخدام مصيدة أيون في نطاق المسح 50-1000 م / ع.

تم تحويل المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام كاشف طيف الكتلة في وضع التأين الكيميائي (إجمالي تيار الأيونات) إلى تنسيق نصي باستخدام برنامج Qual Browser من حزمة Xcalibur (Thermo Sci ، الولايات المتحدة). تمت معالجة المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة المكون الرئيسي المطبقة في حزمة Statistica 10 وأدوات لتحليل الكتلة وإنشاء مخططات dendrogram. تم استخدام كتيب لتفسير أطياف الكتلة وتحديد المركبات الفردية.

النتائج والمناقشة

كطريقة أولية للتكيف ، تم استخدام طريقة المرحلة الصلبة لاستخراج المنشطات من مصل الدم وبلازما الدم ، الموصوفة في دليل شركة "Macherey-Nagel" لاستخراج المرحلة الصلبة. دليل التطبيق ، والذي يحتوي على توصيات لاستخدام أعمدة SPE. مكنت تقنية تحضير العينة المتوافقة مع الاستخراج في المرحلة الصلبة من عزل الفوسفوليبيدات والمنشطات الهيدروكسي والأحماض الدهنية بكفاءة من مصل الدم لخنازير غينيا.

تتيح تقنية الفصل الكروماتوغرافي الموصوفة إمكانية الفصل الفعال بين هرمونات الستيرويد ودهون المصل.

تم تحليل العينات وفقا للطرق الموصوفة. على التين. 1 (انظر صفحة الغلاف الثانية) للحصول على مثال ، يتم عرض مخططات كروماتوجرام متراكبة تم الحصول عليها من تحليل 3 عينات من المجموعة التجريبية (مظللة

أرز. الشكل 4. أطياف كتلة المادة مع زمن استبقاء 21.5 دقيقة: أ - التأين الكيميائي عند الضغط الجوي في الوضع السالب ؛ ب - التأين الكيميائي عند الضغط الجوي بشكل إيجابي.

باللون الأحمر) و 3 عينات من مجموعة التحكم (مظللة باللون الأزرق). ولوحظ نمط مماثل في حالات أخرى.

لمعالجة صفائف البيانات هذه ، تم استخدام طريقة المكون الرئيسي (PCA) والتحليل العنقودي ، مما جعل من الممكن تحديد الاختلافات في ملفات تعريف الدهون بين المجموعتين الضابطة والتجريبية. تم الحصول على قطعة PCA للمكونات الرئيسية الأولى والثانية

عندما يتم تقليل أبعاد البيانات ، يظهر في الشكل. 2 (انظر صفحة الغلاف الثانية). في الرسم البياني ، من السهل أن ترى أن النقاط مجمعة في مجموعتين ، تقعان على التوالي في الأرباع الأول والرابع والثاني والثالث. في هذه الحالة ، تقع النقاط المقابلة للعينات التجريبية بشكل أساسي في الربعين الأول والرابع ، ويتم تحديد النقاط المقابلة لعينات التحكم في الربعين الثاني والثالث. تم الحصول على مخطط dendrogram مع

[الضبع والصرف الصحي 3/2014

تحديد القمم الموجودة في الكروماتوجرام

وقت الاستبقاء ، الحد الأدنى للقمم الرئيسية في الوضع "+" القمم الرئيسية في الوضع "-"

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

مستوى

فسفاتيديل كولين

حمض الأراكينيك

حمض الفوسفاتيك 42: 4

أحماض أراكيك ودوكوسات ترينويك

دوكوسابنتاينويك

حمض اللينوليك

ديهيدروكسي كوليسترول

يظهر التحليل الصارم في الشكل. 3. وهكذا فإن التحليل الإحصائي للبيانات الكروماتوجرافية يشير إلى الفروق في عمليات التمثيل الغذائي التي تحدث في الكائنات الحية لحيوانات التجارب المنتمية إلى المجموعتين الضابطة والتجريبية.

لتحديد التغيرات الأيضية المحددة ، تم فك رموز أطياف الكتلة وتحديدها

يتم اقتباس المركبات الفردية (انظر الجدول). لم يسمح حجم العينة غير الكافي للتحليل باكتشاف التغيرات في ملف هرمونات الستيرويد في مصل الدم. ومع ذلك ، تم الكشف عن الدهون ذات القطبية المتوسطة على الكروماتوجرام.

تم تحديد المركبات الفردية من خلال تحليل أطياف كتلة المواد المسجلة تحت أنماط التأين المختلفة. وهكذا ، يظهر في الشكل الطيف الكتلي لمادة ما في وضعي تأين مع زمن استبقاء 21.5 دقيقة. 4 - أظهر تحليل هذا الطيف أن المادة عبارة عن ثنائي أسيل- sn-glycerophosphate بوزن جزيئي 780 (R1 (311) = 20: 0 حمض دهني (أراكيدك) ، R2 (331) = 22: 4 حمض دهني (docosatetraenoic) ).

لقد وجد أن ذروة الكروماتوغرافيا مع وقت استبقاء 42.52 دقيقة تتوافق مع ثنائي هيدروكسي كوليسترول ، ويفترض أنه أحد السلائف في التخليق الحيوي للأحماض الصفراوية. تشير الاختلافات في محتوى الأوكسيستيرويد في مصل الدم إلى حدوث انتهاك محتمل لعملية التمثيل الغذائي للأحماض الصفراوية. يمكن ملاحظة أن مخططات الكروماتوجرام الموضحة في الشكل. 1 ، في مصل الدم لحيوانات التجارب ، هناك تركيز متزايد من الأوكسيستيرويدات مقارنةً بالمجموعة الضابطة (الذروة مع وقت الاحتفاظ 35-45 دقيقة).

استنتاج. تتيح التقنية المستخدمة في العمل الكشف عن اضطرابات التمثيل الغذائي للدهون المبكرة تحت تأثير الملوثات البيئية بدرجة عالية من الكفاءة. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن إعطاء المحاليل المائية لمقالب الملح لحيوانات التجارب Cavia porcellus يؤدي إلى تغيير في التمثيل الغذائي للدهون والأوكسيستيرويدات. على وجه الخصوص ، قد يترافق المحتوى المرتفع الملحوظ من سلائف حمض الصفراء (هيدروكسيستيرويدات) في الحيوانات مع ضعف وظائف الكبد والإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للأحماض الصفراوية. وبالتالي ، يمكن استخدام النهج الموصوف للكشف عن اضطرابات التمثيل الغذائي للدهون في سكان المناطق ذات التلوث التكنولوجي.

المؤلفات

1. Horning EC، Horning M.G. الملامح الأيضية: طرق المرحلة الغازية لتحليل المستقلبات. كلين. تشيم. 1971 ؛ 17 (8): 802-9.

2. كونستانتينو إم إيه ، تسانتيلي كاكوليدو أ ، أندريدو آي ، إلودرو ميتيس إي كيه ، كريماستينوس دي تي ، ميكروس إي تطبيق الأيض القائم على الرنين المغناطيسي النووي في التحقيق في نقص تروية عضلة القلب ، إعادة التروية ، التكييف المسبق الإقفاري والتدخل المضاد للأكسدة في الأرانب. يورو. J فارم. الخيال. 2007 ؛ 30 (3-4): 303-14.

3. لو دبليو ، بينيت بي دي ، رابينوفيتز ج. استراتيجيات تحليلية لعمليات الأيض المستهدفة المستندة إلى LC-MS. تشروماتوجر ي. B. Analyt. تكنول. بيوميد. علوم الحياة. 2008 ؛ 871 (2): 236-42.

4. Novotny M.V، Soini H. تشروماتوجر ي. B. Analyt. تكنول. بيوميد. علوم الحياة. 2008 ؛ 866 (1-2): 26-47.

5. German J.B.، Gillies L.A.، Smilowitz J.T.، Zivkovic A.M.، Watkins S.M. علم الدهون وتنميط الدهون في التمثيل الغذائي. بالعملة. رأي. ليبيدول. 2007 ؛ 18 (1): 66-71.

6. Schwarz E. ، Liu A. ، Randall H. ، Haslip C. ، Keune F. ، Murray M. et al. استخدام التنميط الستيرويد بواسطة UPLC-MS / MS كاختبار من الدرجة الثانية في فحص حديثي الولادة لتضخم الغدة الكظرية الخلقي: تجربة يوتا. بيدياتر. الدقة. 2009 ؛ 66 (2): 230-5.

7. قياس الستيرويد باستخدام LC-MS / MS. طلب

للفن. تشاخوفسكي وآخرون.

أرز. 3. Dendrogram مبني على أساس التحليل العنقودي ويوضح تجميع العينات حسب المجموعات.

للفن. تشاخوفسكي وآخرون.

أرز. 1. مخططات كروماتوجرام متداخلة للعينات 1-3 من المجموعة الضابطة (مظللة باللون الأحمر) و 15-17 من المجموعة التجريبية (مظللة باللون الأزرق).

إسقاط الحالات على مستوى العامل (1 × 2) الحالات بمجموع مربع جيب التمام> = 0.00

18/3 9 / z 21/1 ■ O

قرض واحد "ش حوالي 28/1" 22/10 41/1 ص

العامل 1: 65.71٪

أرز. 2. تم الحصول على الرسم البياني بمعالجة اللوني باستخدام PCA. تم تمييز المجموعة الضابطة باللون الأزرق ، والمجموعة التجريبية باللون الأحمر.

الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي طريقة كروماتوغرافيا العمود حيث يكون الطور المتحرك (MP) سائلًا يتحرك عبر عمود كروماتوغرافي مملوء بمرحلة ثابتة (مادة ماصة). تتميز أعمدة HPLC بضغط هيدروليكي مرتفع عند مدخل العمود ، ولهذا السبب يشار إلى HPLC أحيانًا باسم "كروماتوجرافيا السائل عالي الضغط".

اعتمادًا على آلية فصل المواد ، يتم تمييز المتغيرات التالية لـ HPLC: الامتزاز ، التوزيع ، التبادل الأيوني ، الاستبعاد ، اللولب ، إلخ.

في كروماتوغرافيا الامتزاز ، يحدث فصل المواد بسبب قدرتها المختلفة على الامتصاص والامتصاص من سطح مادة ماصة ذات سطح مطور ، على سبيل المثال ، هلام السيليكا.

في قسم HPLC ، يحدث الفصل بسبب الاختلاف في معاملات التوزيع للمواد المراد فصلها بين المراحل الثابتة (كقاعدة عامة ، المطعمة كيميائياً على سطح الدعم الثابت) والمراحل المتنقلة.

بالقطبية ، يتم تقسيم PF و NF HPLC إلى طور عادي ومرحلة معكوسة.

كروماتوغرافيا الطور الطبيعي هي البديل الكروماتوغرافي الذي يستخدم مادة ماصة قطبية (على سبيل المثال ، هلام السيليكا أو هلام السيليكا مع مجموعات NH 2 - أو CN مطعمة) و PF غير قطبي (على سبيل المثال ، الهكسان مع إضافات مختلفة). في كروماتوغرافيا الطور العكسي ، يتم استخدام مواد ماصة معدلة كيميائيًا غير قطبية (على سبيل المثال ، شقوق ألكيل غير قطبية C 18) وأطوار متحركة قطبية (على سبيل المثال ، ميثانول ، أسيتونتريل).

في كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، يتم فصل جزيئات مواد الخليط ، المنفصلة في المحلول إلى كاتيونات وأنيونات ، عند التحرك عبر المادة الماصة (مبادل الكاتيون أو مبادل الأنيون) بسبب معدلات التبادل المختلفة مع المجموعات الأيونية للمادة الماصة .

في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الغربال ، اختراق الهلام ، الترشيح الهلامي) ، يتم فصل جزيئات المواد حسب الحجم بسبب قدرتها المختلفة على اختراق مسام المرحلة الثابتة. في هذه الحالة ، فإن الجزيئات الأكبر (ذات الوزن الجزيئي الأعلى) القادرة على اختراق الحد الأدنى لعدد المسام في المرحلة الثابتة هي أول من يغادر العمود ، والمواد ذات الأحجام الجزيئية الصغيرة هي آخر من يغادر.

في كثير من الأحيان لا يتم الفصل من خلال آلية واحدة ، ولكن من خلال عدة آليات في وقت واحد.

يمكن استخدام طريقة HPLC لمراقبة الجودة لأي مادة تحليلية غير غازية. للتحليل ، يتم استخدام الأدوات المناسبة - الكروماتوغرافيا السائلة.

عادة ما يتضمن تكوين الكروماتوجراف السائل المكونات الرئيسية التالية:

- وحدة تحضير PF ، بما في ذلك خزان بمرحلة متحركة (أو خزانات بها مذيبات فردية تشكل جزءًا من الطور المتحرك) ونظام تفريغ غاز PF ؛

- نظام الضخ

- خلاط الطور المتحرك (إذا لزم الأمر) ؛

- نظام حقن العينة (الحاقن) ؛

- عمود كروماتوغرافي (يمكن تركيبه في منظم حرارة) ؛

- كاشف

- نظام جمع ومعالجة البيانات.

نظام الضخ

توفر المضخات PF للعمود مع معين سرعة ثابتة. يمكن أن يكون تكوين المرحلة المتنقلة ثابتًا أو يتغير أثناء التحليل. في الحالة الأولى ، تسمى العملية إيزوقراطية ، وفي الحالة الثانية - التدرج. يتم أحيانًا تركيب المرشحات التي يبلغ قطر مسامها 0.45 ميكرومتر قبل نظام الضخ لتصفية الطور المتحرك. يتكون نظام ضخ الكروماتوجراف السائل الحديث من مضخة واحدة أو أكثر يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. يسمح لك هذا بتغيير تكوين PF وفقًا لبرنامج معين أثناء شطف التدرج. يمكن أن يحدث خلط مكونات PF في الخلاط عند ضغط منخفض (قبل المضخات) وضغط مرتفع (بعد المضخات). يمكن استخدام الخلاط لتحضير PF وللشطف المتساوي ، ومع ذلك ، يتم تحقيق نسبة أكثر دقة للمكونات عن طريق الخلط المسبق لمكونات PF للعملية المتساوية. تتيح مضخات HPLC التحليلية الحفاظ على معدل تدفق ثابت لـ PF في العمود في نطاق من 0.1 إلى 10 مل / دقيقة عند ضغط مدخل عمود يصل إلى 50 ميجا باسكال. ومع ذلك ، فمن المستحسن ألا تتجاوز هذه القيمة 20 ميجا باسكال. يتم تقليل نبضات الضغط من خلال أنظمة المثبط الخاصة المضمنة في تصميم المضخات. أجزاء العمل للمضخات مصنوعة من مواد مقاومة للتآكل ، مما يسمح باستخدام مكونات قوية في تكوين PF.

تم تطوير طريقة HPLC-MS / MS تم التحقق من صحتها لتحديد وقياس مشتق الأحماض الأمينية الجديد لـ1،3،4-ثياديازول LHT7-09. تم تحقيق أقصى حساسية للكشف عن مقياس الطيف الكتلي LHT7-09 في وضع الكشف عن الأيونات الموجبة بجهد رش كهربائي يبلغ 5500 فولت وإمكانية فك الضغط تبلغ 36 فولت ، وأكدت انتقالات MRM المحددة التركيب الكيميائي لمشتق الأحماض الأمينية الجديد 1 ، 3،4-ثياديازول. لعزل LHT7-09 بشكل فعال من الخلائط متعددة المكونات من ثياديازوليلاميدات ، تم تطوير نمط متدرج للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء باستخدام مزيج من الأسيتونتريل والماء منزوع الأيونات بنسب مختلفة. بالنسبة لهذه الظروف الكروماتوجرافية ، تم تحديد وقت استبقاء المركب LHT7-09 ليكون 11 دقيقة. من أجل التحديد الكمي للمركب LHT7-09 ، تم تطوير محلول معايرة لاعتماد منطقة الذروة الكروماتوغرافية على تركيز المحلول.

whr-ms / ms

كروماتوغرافيا

قياس الطيف الكتلي

ثياديازول

1. Kazaishvili Yu.G.، Popov N.S. دراسة النشاط المضاد للالتهابات لمشتقات الثياديازول الجديدة في وذمة مخلب الفورمالين في الفئران / Yu.G. كازايشفيلي ، ن. بوبوف // قضايا معاصرةالعلم والتعليم. - 2013. - رقم 3. www ..

2. مشتقات ثياديازول الجديدة ذات النشاط المضاد للفطريات / A.S. Koshevenko [وآخرون] // التقدم في علم الفطريات الطبية. - 2015. - ت 14. - س 348-351.

3. التوليف والنشاط المضاد للورم من جديد furyl-2-البديل 1،3،4-ثياديازول ، 1،2،4-تريازول / T.R. Ovsepyan [وآخرون] // المجلة الصيدلانية الكيميائية. - 2011. - ت 45. - رقم 12. - ص 3-7.

4. بوبوف إن إس ، ديميدوفا م. تقييم السمية الحادة لمشتق حمض أميني جديد من الثياديازول عند إعطائه داخل الصفاق للفئران / N.S. بوبوف ، م. ديميدوف // فولغا العليا المجلة الطبية. - 2016. - V. 15 ، لا. 1. - ص 9-12.

5. بوبوف إن إس ، ديميدوفا م. تقييم التقرح لمشتق حمض أميني جديد من الثياديازول عند تناوله داخل المعدة للفئران / N.S. بوبوف ، م. ديميدوفا // طالبة دكتوراه. - 2017. - رقم 1 (80). - ص 71-78.

6 - تخليق ونشاط مضاد للميكروبات لأميدات حمض فينيل ثيو وبنزيل سلفونيل أسيتيك على أساس 2-أمينو-5-ألكيل (أريلالكيل) -1،3،4-ثياديازول / S.A. Serkov [وآخرون] // المجلة الصيدلانية الكيميائية. - 2014. - ت 48 ، رقم 1. - س 24-25.

7. Arpit K. ، Basavaraj M. ، Sarala P. ، Sujeet K. ، Satyaprakash K. التركيب والنشاط الدوائي لمشتقات imidazothiadiazole // Acta Poloniae Pharmaceutica ، Drug Research. 2016. المجلد. 73- لا. 4. ص 937-947.

8. إيمان م. فليفيل ، وائل عبد العزيز السيد ، أشرف محمد محمد ، التوليف والنشاط المضاد للسرطان من 1-ثيا-4-آزاسبيروديكان الجديد ، ثيازولوبيريميدين المشتق و 1،3،4-ثياديازول ثيوجليكوزيدات // جزيئات. 2017. لا. 22 (1). ص 170.

9. خورخي ر. دياز ، جيراردو إنريكي كامي. تُظهر أملاح 5-amino-2-sulfonamide-1،3،4-thiadiazole ، وهي هيكلية وتناظرية من acetazolamide ، خصائص مثبطة لـ Carbonic anhydrase ومدر للبول ومضاد للاختلاج // مجلة تثبيط الإنزيم والكيمياء الطبية. 2016. المجلد. 12. لا. 6. ص 1102-1110.

10. Naiyuan Chen ، Wengui D. ، Guishan L. ، Luzhi L. التوليف والنشاط المضاد للفطريات لمركبات حامض dehydroabietic 1،3،4-thiadiazole-thiazolidinone // التنوع الجزيئي. 2016. المجلد. 20. لا. 4. ص 897-905.

11. يمنى ، إبراهيم الجزار ، حنان جورجي ، شاهندا محمد المسيري. التوليف والتقييم البيولوجي ودراسة النمذجة الجزيئية لمشتقات جديدة (1،2،4-تريازول أو 1،3،4-ثياديازول) -ميثيلثيو- مشتقات كينازولين -4 (3H) - واحدة كمثبطات DHFR // كيمياء عضوية حيوية. 2017 المجلد. 72. ص 282-292.

يعد الفصل اللوني السائل عالي الأداء مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي أحد أكثر الطرق الواعدة لتحديد وتقدير المواد الطبيةفي كائنات بيولوجية مختلفة. تتميز الطريقة بدقة عالية وقدرة على تحديد المواد بتركيزات قليلة ، مما يسمح باستخدامها في التحديد الكمي للأدوية في دراسات الحرائك الدوائية ومراقبة الأدوية ، وهو أمر مهم للتشخيصات المخبرية السريرية. لهذا الغرض ، من الضروري تطوير والتحقق من صحة طرق التحديد الكمي للمواد الطبية المختلفة ، بما في ذلك المواد المبتكرة ، بناءً على طريقة HPLC-MS / MS.

الدواء الأصلي من مجموعة العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات هو acexazolamide ، وهو مشتق جديد من 1،3،4-thiadiazole amide وحمض acexamic. من المزايا المهمة لهذا المركب انخفاض سميته وانخفاض التقرح. من أجل إجراء دراسات الحرائك الدوائية وتقييم التوافر البيولوجي لمادة طبية معينة مع طرق مختلفة للإعطاء ، من الضروري تطوير طريقة موثوقة لتحديدها الكمي في السوائل البيولوجية.

الغرض من هذه الدراسةتم تطوير منهجية لتحديد وقياس عقار جديد مضاد للالتهاب غير الستيرويدي من مجموعة مشتقات الثياديازول باستخدام HPLC-MS / MS.

المواد والأساليب

كان الهدف من الدراسة هو مشتق ثياديازول جديد برمز المختبر LHT 7-09 ، تم تصنيعه في JSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) الأستاذ. S.Ya. سكاتشيلوفا (الشكل 1).

2- (5-إيثيل-1،3،4-ثياديازوليل) أميد 2-acetylaminohexanoic acid

أرز. 1. التركيب الكيميائي لـ LHT 7-09 (الصيغة الإجمالية: C 12 H 20ن 4 حوالي 2س؛ الكتلة المولية 284.4ز / مول)

LHT 7-09 الوصلة في المظهر عبارة عن مسحوق أبيض ، غير قابل للذوبان عمليًا في الماء ، قابل للذوبان في الكحول ، قابل للذوبان بسهولة في الأسيتونيتريل.

تم استخدام طريقة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS / MS) لتحديد وقياس LCT 7-09.

تم إجراء الكروماتوغرافيا باستخدام جهاز كروماتوجراف سائل عالي الأداء Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies ، ألمانيا). تم استخدام عمود تحليلي Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1 × 10 مم في الدراسة. لعزل المركب قيد الدراسة ، قمنا بتطوير وضع كروماتوغرافيا متدرجة. تم استخدام الأسيتونيتريل والماء منزوع الأيونات وخلات الأمونيوم كمادة شطف بنسب مختلفة.

لقياس الطيف الكتلي ، تم استخدام مطياف الكتلة رباعي الأقطاب ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex ، سنغافورة) مع مصدر أيون بالرش الكهربائي (TurboV مع مسبار TurboIonSpray). تمت معايرة مطياف الكتلة باستخدام محلول اختبار من ريزيربين بتركيز 6.1 × 10 -2 مجم / لتر.

تم إجراء التحليل الطيفي الكتلي للعينات المدروسة في وضع الرش الكهربائي مع الحقن المباشر للعينة والنتيجة التي يوفرها الكروماتوجراف. تم إجراء الحقن المباشر لعينات الاختبار في كروماتوجراف الكتلة باستخدام مضخة حقنة بقطر 4.61 مم بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة.

عند تطوير تقنية للتعرف والتحديد الكمي لمشتق ثياديازول جديد ، تم اختيار الظروف المثلى للكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء والكشف عن الكتلة. تم أخذ وقت خروج المادة من العمود الكروماتوغرافي وانتقال MRM في الاعتبار (تم إجراء التسجيل م/ ضأيون السلائف على أول رباعي القطب التحليلي Q1 و م/ ضأيونات المنتج في التحليل الرباعي الثاني Q3). من أجل التحديد الكمي لـ LHT 7-09 ، تم إنشاء رسم بياني للمعايرة في نطاق التركيز من 0.397 إلى 397 نانوغرام / مل.

تم استخدام برنامج AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) كبرنامج.

النتائج والمناقشة

في المرحلة الأولى من الدراسة التجريبية ، تم إجراء الكشف الشامل لعينة الاختبار عن طريق الحقن المباشر في كاشف الكتلة باستخدام مضخة حقنة. في مرحلة تحضير العينة ، تم الحصول على محلول LHT 7-09 (500 نانوغرام / مل) في خليط من الأسيتونيتريل والماء المتأين بنسبة 2: 1 مع إضافة أسيتات الأمونيوم (0.1٪).

أظهرت التجارب الأولية أنه في وضع الكشف عن الأيونات الموجبة ، كانت حساسية اكتشاف LCT 7-09 أعلى ، وكان الطيف الكتلي أكثر كثافة وغنية بالمعلومات من وضع الكشف عن الأيونات السالبة. في هذا الصدد ، في مزيد من الدراسات ، تم استخدام وضع التأين الإيجابي فقط.

للحصول على ذروة مكثفة ، تم اختيار شروط الكشف الشامل التالية: : استقطاب موجب ، جهد رش كهربائي 5500.0 فولت ، جهد فصل وإمكانية إدخال 36.0 و 6.5 فولت ، على التوالي ، عند ضغط غاز ستارة 20.0 رطل / بوصة مربعة وغاز بخاخ 40.0 رطل / بوصة مربعة ، بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة. كان نطاق المسح 270-300 دا.

أظهر تحليل الطيف الكتلي الذي تم الحصول عليه في التحليل الرباعي الأول Q1 أنه في ظل هذه الظروف ، وبسبب إضافة بروتون الهيدروجين ، يتشكل جزيء بروتوني للمركب المدروس + بالقيمة م/ ض 285.2 نعم (الشكل 2).

أرز. 2. الطيف الكتلي لجزيء LHT 7-09 البروتوني (في وضع مسح الأيونات الموجبة +)

في الربع الثاني التحليلي الرباعي Q3 ، تم تسجيل أيونات المنتج لأيون السلائف بالقيمة م / ض 285.2 نعم. أظهر تحليل الطيف الكتلي من الدرجة الثانية وجود العديد من القمم ، كان 3 منها الأكثر كثافة - م / ض 114.2 دا ، م / ض 130.2 دا و م / ض 75.1 دا (الشكل 3).

أرز. 3. الطيف الكتلي لأيونات المنتج (في وضع مسح الأيونات الموجبة ، السلائف أيونم/ ض285.2 نعم)

للحصول على إشارة أيون عالية الكثافة ، تم اختيار قيم الطاقة المثلى في خلية تصادم Q2 (تم النظر في نطاق الطاقة من 0 إلى 400 فولت). لأيونات المنتج ذات القيم م/ ض 114.2 Da و 130.2 Da و 75.1 Da ، كانت الطاقة المثلى في خلية التأثير 27 فولت ، على التوالي ؛ 23 فولت و 49 فولت.

من المفترض أن يكون أيون المنتج مع القيمة م/ ض 114.2 دا عبارة عن جزء من 5-أمينو-2-إيثيل-1،3،4-ثياديازول ، نظرًا لأن تجزئة مشتقات 1،3،4-ثياديازول الأخرى تكشف أيضًا عن أيون منتج بنفس القيمة م/ ض. منتج أيون ذو قيمة م/ ض 130.2 دا هو على الأرجح جزء بروتوني من حمض الأسيكساميك. وهكذا أكدت نتائج الكشف الشامل للعينة المدروسة التركيب الكيميائي لمشتق 1،3،4-ثياديازول الجديد.

في المرحلة التالية من الدراسة التجريبية ، تم تحليل المركب الذي تم تحليله بواسطة مطياف الكتلة HPLC.

في وضع HPLC-MS / MS ، تم استخدام ظروف التأين التالية: جهد الرش الكهربائي 5500.0 فولت ، معدل تدفق الطور المتحرك 400 ميكرولتر / دقيقة ، درجة حرارة النيتروجين 400 درجة مئوية ، ضغط الغاز الستارة وتدفق الرش 20.0 و 50.0 رطل لكل بوصة مربعة ، على التوالي. كان معدل تسجيل أطياف الكتلة الواحدة 100 طيف في الثانية. للحصول على طيف كتلي مُلخص على مخطط كروماتوجرام ، تم تخصيص فاصل زمني من 10.5-11.5 دقيقة ؛ وفقًا لشدة إشارة أيونات المنتج ، تم رسم منحنيات اعتماد الوقت للتيار الأيوني ومنطقة قمم الإشارات الفردية المقابلة لمركب الاختبار. كان حجم العينة المحقونة في العمود التحليلي 10 ميكرولتر.

لعزل المركب قيد الدراسة ، تم استخدام أسلوب التدرج اللوني للسائل عالي الأداء ، والذي تم توفيره عن طريق تغيير تركيبة المادة عند مدخل العمود التحليلي. تم استخدام الأسيتونيتريل والماء منزوع الأيونات وخلات الأمونيوم كمادة شطف بنسب مختلفة. كان اختيار وضع التدرج اللوني للكروماتوغرافيا يرجع إلى حقيقة أنه في ظل ظروف وضع الشطف المتساوي (بما في ذلك استخدام تركيزات مختلفة من الأسيتونتريل) ، لم يكن من الممكن الحصول على ذروة مادة الاختبار ذات الشكل المتماثل مع وقت استبقاء مناسب للتحليل. وفقًا للدراسة ، كان وضع العرض التالي هو الأمثل: من 0 إلى 4 دقائق ، كان تركيز الأسيتونيتريل 1٪ ؛ من 4 إلى 8 دقائق زيادة خطية في تركيز الأسيتونيتريل تصل إلى 99٪ ؛ من 8 إلى 12 دقيقة - قسم إيزوقراطي (1٪ أسيتونيتريل). عند الانتهاء من الدراسة ، تم غسل العمود الكروماتوجرافي بمحلول أسيتونيتريل 30٪ لمدة 5 دقائق.

عند استخدام الوضع اللوني الموصوف للمركب المدروس ، تم الحصول على ذروة متناظرة من الشدة الكافية (الشكل 4).

أرز. 4. اللوني LHT 7-09 (عمود تحليليأجيلينتبوروشيل 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1x10 مم ؛ كروماتوغرافيا وضع التدرج)

أظهر تحليل المخططات اللونية التي تم الحصول عليها لمحاليل LHT 7-09 بتركيزات مختلفة أن زمن الاستبقاء (tR) في ظل ظروف الشطف هذه كان 11 دقيقة ولم يعتمد على تركيز مادة الاختبار. في هذا الصدد ، يمكن استخدام قيمة وقت الاحتفاظ كمعيار إضافي لتأكيد صحة LHT 7-09 في الخلائط متعددة المكونات. من الجدير بالذكر أنه يمكن استخدام هذه المعلمات اللونية لتحديد LHT 7-09 ليس فقط باستخدام كاشف الكتلة ، ولكن أيضًا مع أجهزة الكشف الأخرى ، بما في ذلك جهاز قياس الضوء.

من أجل التحديد الكمي لمشتق الثياديازول الجديد ، تم إنشاء منحنى معايرة في نطاق التركيز من 0.397 نانوغرام / مل إلى 397 نانوغرام / مل (الشكل 5).

أرز. الشكل 5. رسم بياني للمعايرة لتحديد تركيز LHT 7-09 (على طول محور الإحداثي - تركيز LHT 7-09 في نانوغرام / مل ، على طول المحور الإحداثي - منطقة الذروة في البقول)

لتطوير محلول معايرة ، تم استخدام محاليل LHT 7-09 بتركيزات 0.397 ؛ 1.980 ؛ 3.970 ؛ 19.8 ؛ 39.7 ؛ 198.0 ؛ 397.0 نانوغرام / مل. تم وصف اعتماد منطقة الذروة على تركيز المركب المدروس بواسطة معادلة الانحدار التالية:

ص = 8.9e 5 × 0.499 ، كانت قيمة معامل الانحدار r = 0.9936.

وتجدر الإشارة إلى أن محلول المعايرة المطور يجعل من الممكن إجراء التحديد الكمي للمركب المدروس بدقة عالية في نطاق واسع من التركيزات ، مما يجعل من الممكن استخدام هذه الطريقة لتقييم جودة المادة الدوائية و إجراء دراسات حركية الدواء.

وبالتالي ، كانت نتيجة الدراسة تطوير طريقة لتحديد وتقدير مشتق حمض أميني جديد من الثياديازول باستخدام HPLC-MS / MS.

الاستنتاجات

1. يسمح HPLC-MS / MS بتحديد وقياس مشتق حمض أميني جديد من الثياديازول بدقة عالية.
2. يجب إجراء الكشف الشامل عن مشتق الثياديازول الجديد LHT 7-09 في وضع المسح الأيوني الموجب (انتقال MRM - أيون السلائف Q1 م/ ض 285.2 نعم ؛ منتج أيونات Q3 م/ ض 114.2 دا ، م/ ض 130.2 دا و م/ ض 75.1 دا).
3. لعزل LCT 7-09 من الخلائط متعددة المكونات ، تم تطوير تقنية كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (العمود التحليلي Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1 × 10 مم ؛ أسيتونيتريل eluent: ماء منزوع الأيونات: أسيتات الأمونيوم ؛ وضع التدرج).

رابط ببليوغرافي

وفقًا لمراجعة نُشرت في Clinical Biochemist Reviews ، فإن استخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء جنبًا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي الترادفي (HPLC-MS / MS) في المختبرات السريرية قد زاد بشكل كبير على مدى السنوات العشر إلى الـ12 الماضية. لاحظ المؤلفون أن خصوصية تحليل HPLC-MS / MS تتفوق بشكل كبير على الطرق المناعية والكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء الكلاسيكية (HPLC) في تحليل الجزيئات ذات الوزن الجزيئي المنخفض ولها إنتاجية أعلى بكثير من قياس الطيف الكتلي للكتلة الغازية (كروماتوغرافيا الغاز). GC-MS). تفسر شعبية هذه الطريقة في التحليلات السريرية الروتينية حاليًا بالقدرات الفريدة لهذه الطريقة.

المزايا الرئيسية لطريقة HPLC-MS / MS هي:
• القدرة على قياس الجزيئات الصغيرة بدقة ؛
• التحليل المتزامن للمركبات المستهدفة المتعددة ؛
• خصوصية فريدة
• سرعة تحليل عالية.

في السنوات الاخيرةيتم إيلاء الكثير من الاهتمام لوقت التحليل ، ونتيجة لذلك ، لزيادة إنتاجية المختبر. تم تقليل وقت التحليل بشكل كبير من خلال استخدام أعمدة تحليلية قصيرة لـ HPLC / MS / MS ، مع زيادة خصوصية التحليل بشكل كبير. أدى استخدام التأين بالضغط الجوي (API) ، ومقياس الطيف الكتلي الثلاثي الرباعي الترادفي ، والكروماتوجرافيا السائلة المتقدمة عالية الأداء ، بالإضافة إلى طرق تحضير العينات ذات الصلة ، إلى جعل LC / MS / MS في طليعة الأساليب التحليلية الحديثة للبحث السريري.

المجالات الرئيسية لتطبيق HPLC / MS / MS في الطب السريري:
• الحصول على ملف تعريف كامل لعملية التمثيل الغذائي للستيرويدات (لوحات المنشطات) ، البيورينات والبيريميدين والمركبات الأخرى ،
  فحص الأطفال حديثي الولادة بحثًا عن أخطاء التمثيل الغذائي الخلقية (الكشف عن عشرات الأمراض في تحليل واحد) ؛
• المراقبة العلاجية أدوية- مثبطات المناعة ، ومضادات الاختلاج ، ومضادات الفيروسات القهقرية ، ومضادات التخثر ، وأي أدوية أخرى - بغض النظر عن توافر مجموعات الشركة المصنعة. لا حاجة لشراء مجموعات باهظة الثمن لكل مادة - يمكنك تطوير أساليبك الخاصة ؛
• علم السموم السريرية - تحليل أكثر من 500 من المركبات المخدرة ومستقلباتها في تحليل واحد ، دون تحليل تأكيدي
  البروتينات والأيض.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام HPLC-MSMS لفحص قليل السكاريد البولي ، الكبريتيد ، السلسلة الطويلة أحماض دهنية، سلسلة طويلة الأحماض الصفراوية، وحمض الميثيل مالونيك ، وأبحاث البورفيريا ، وفحص المرضى الذين يعانون من اضطرابات في استقلاب البيورين والبيريميدين.

أمثلة تطبيقية للكروماتوغرافيا السائلة
بالاشتراك مع مطياف الكتلة الترادفية في المقايسات السريرية.

فحص حديثي الولادة:المثال الأول للتطبيق الشامل لـ HPLC-MS / MS في التشخيص السريريتم فحص الأخطاء الأيضية الخلقية عند الأطفال حديثي الولادة. حاليا في الدول المتقدمةهذه طريقة روتينية وتغطي أكثر من 30 مرضًا مختلفًا ، بما في ذلك حموضة الدم ، واعتلال الأحماض الأمينية ، وعيوب أكسدة الأحماض الدهنية. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى البحث في العيوب الخلقية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى مشاكل خطيرة إذا لم تتم معالجتها على الفور (على سبيل المثال ، تضخم القلب أو الكبد ، أو الوذمة الدماغية). تتمثل ميزة استخدام HPLC-MS / MS لفحص حديثي الولادة في القدرة على تحليل جميع الأحماض الأمينية وأسيل كارنيتين في وقت واحد بطريقة سريعة وغير مكلفة ومحددة للغاية.

رصد المخدرات العلاجية:كان تطوير وإدخال sirolimus (rapamycin) المثبط للمناعة لمنع رفض الأعضاء بعد الزرع أحد الدوافع الرئيسية لإدخال HPLC-MS / MS في المختبرات السريرية. الطريقة الحديثةيسمح HPLC-MS / MS بتحديد متزامن لـ tacrolimus و sirolimus و cyclosporine و everolimus و mycofenoic acid.

يستخدم HPLC-MS / MS أيضًا لتحليل الأدوية السامة للخلايا والأدوية المضادة للفيروسات القهقرية ومضادات الاكتئاب ثلاثية الحلقات ومضادات الاختلاج والأدوية الأخرى التي تتطلب جرعات فردية.

تجعل طريقة HPLC-MSMS من الممكن فصل وتحديد R- و S- enantiomers من الوارفارين في نطاق تركيز 0.1-500 نانوغرام / مل.

الأدوية والمسكنات:يستخدم HPLC-MS / MS على نطاق واسع لتحليل هذه المركبات نظرًا لسهولة تحضير العينة وأوقات التحليل القصيرة. تُستخدم الطريقة حاليًا في المختبرات السريرية لفحص وجود مجموعة واسعة من الأدوية. تجعل الخصوصية والحساسية الفريدة للطريقة من الممكن تحليل أكثر من 500 مركب من فئات مختلفة في وقت واحد في عينة واحدة مع الحد الأدنى من تحضير العينة. لذلك ، في حالة تحليل البول ، يكون التخفيف البسيط للعينة بنسبة 50-100 مرة كافياً. عند تحليل الشعر ، بدلاً من مجموعة من 100-200 شعرة ، فإن شعرة واحدة كافية لتحديد حقائق تعاطي المخدرات بشكل موثوق.

طب الغدد الصماء وتحليل الستيرويد:يستخدم HPLC-MS / MS على نطاق واسع في العديد من مختبرات الغدد الصماء لتحليل المنشطات - التستوستيرون والكورتيزول والألديستيرون والبروجسترون والإستريول وغيرها الكثير.

المزيد والمزيد من المختبرات بدأت في استخدام HPLC-MS / MS لتحديد مستويات الدم من فيتامين D3 و D2.

I. تعريف المنشطات (ملف تعريف الستيرويد).

تمتلك المعامل في المستشفيات والعيادات الآن القدرة على إجراء التحديد المتزامن للعديد من المنشطات باستخدام HPLC / MS / MS. ليست هناك حاجة إلى حجم عينة كبير ، وهو أمر مهم بشكل خاص عند تحليل عينات الأطفال.

الحالات التي يُنصح فيها بإجراء تحديد العديد من المنشطات (التنميط):
• تضخم الغدة الكظرية الخلقي (CAH) هو عيب خلقي في التخليق الحيوي للستيرويد. هذه مجموعة وراثية من الأمراض الناتجة عن النشاط غير السليم لأنزيمات قشرة الغدة الكظرية ، مما يؤدي إلى انخفاض في إنتاج الكورتيزول. للحصول على تشخيص موثوق لـ SAN ، يوصى بتحديد الكورتيزول والأندروستينيون و 17 هيدروكسي بروجستيرون. يسمح HPLC / MS / MS بتقدير دقيق لجميع المنشطات الثلاثة في تحليل واحد بثقة 100٪.
• يتميز الفحص الروتيني لحديثي الولادة باستخدام المقايسات المناعية بارتفاع معدل النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة للثدي. إن تحديد HPLC / MS / MS ليس فقط للكورتيزول ، ولكن أيضًا الألدوستيرون و 11-ديوكسيكورتيزول يجعل من الممكن التمييز بين قصور الغدة الكظرية الأولي والثانوي.
• يسمح HPLC / MS / MS بتحديد المنشطات في التهاب البروستاتا ومتلازمة آلام الحوض المزمنة.
• يسمح لك HPLC-MS / MS بتحديد ملف الستيرويد وتحديد أسباب البلوغ المبكر للغدة الكظرية عند الأطفال الصغار. وقد وجد أن تركيزات هرمون التستوستيرون ، والأندروستينيون ، وديهيدرو إيبي أندروستيرون (DHEA) وكبريتاته في هؤلاء الأطفال كانت أعلى قليلاً من تلك الموجودة في الأطفال الأكبر سنًا.
• يتم تحليل مصل من المدخنين النشطين والمدخنين السلبيين وغير المدخنين لوجود 15 هرمون ستيرويد وهرمونات الغدة الدرقية للتحقق من الارتباط بين المرضى المعرضين للدخان وتركيزات الهرمونات.
• يستخدم HPLC / MS / MS في تحديد سمات بعض هرمونات الستيرويد الأنثوية في البول.
• باستخدام HPLC / MS / MS ، تم تقييم تركيزات الهرمونات النشطة عصبيًا من أجل الوقاية من الاعتلال العصبي السكري.

ثانيًا. تحديد هرمونات الغدة الدرقية

تعتمد الطرق الروتينية لتحديد هرمونات الغدة الدرقية عادةً على المقايسة المناعية الإشعاعية ، وهي مكلفة ولا تكتشف سوى T3 و T4 ، مما قد يحد من القدرة على تحديد وظيفة الغدة الدرقية وتنظيمها بالكامل.

• حاليًا ، باستخدام HPLC-MSMS ، تحليل متزامن لخمسة هرمونات الغدة الدرقية في عينات مصل الدم ، بما في ذلك هرمون الغدة الدرقية (T4) ، 3،3 '، 5-ثلاثي يودوثيرونين (T3) ، 3،3' ، 5'- (rT3) ، 3 ، 3'-diiodothyronine (3،3'-T2) و 3،5-diiodothyronine (3،5-T2) في نطاق التركيز 1-500 نانوغرام / مل.
• تُستخدم طريقة HPLC / MS / MS أيضًا لتحليل تركيبة الهرمونات في المرضى الذين خضعوا لاستئصال الغدة الدرقية. يتم تحديد مستويات هرمون الغدة الدرقية (T4) وثلاثي يودوثيرونين (T3) و T4 الحر وهرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH) بعد الجراحة. تم العثور على HPLC / MS / MS ليكون وسيلة ممتازة لتأسيس العلاقة بين TSH وتركيزات هرمون الغدة الدرقية.
• تم تطبيق طريقة HPLC / MS / MS لتحديد هرمون الغدة الدرقية (T4) في اللعاب ومصل دم الإنسان. تتميز الطريقة بإمكانية استنساخ عالية ودقة وحد اكتشاف يبلغ 25 بيكوغرام / مل. أظهرت الدراسات أن هناك علاقة تشخيصية في تركيزات T4 اللعابية بين الأشخاص الذين يعانون من قصور الغدة الدرقية والمرضى الذين يعانون من مرض جريفز.

تتميز طريقة HPLC / MS / MS الآن بالحساسية والنوعية والدقة المطلوبة لاكتشاف جميع المنشطات في السوائل البيولوجية بشكل موثوق وبالتالي تزيد من القدرات التشخيصية ، خاصة في حالة مصفوفات الستيرويد.

ثالثا. تحديد 25-هيدروكسي فيتامين د بواسطة HPLC / MS / MS

25-هيدروكسي فيتامين د (25OD) هو الشكل المنتشر الرئيسي لفيتامين د والسلائف لشكله النشط. (1،25-ديوكسي فيتامين د). نظرًا لعمرها النصفي الطويل ، فإن تحديد 25OD مهم لتحديد حالة فيتامين د في جسم المريض. يوجد فيتامين د في شكلين: فيتامين د 3 (كولي كالسيفيرول) وفيتامين د 2 (إرغوكالسيفيرول). يتم استقلاب كلا الشكلين في أشكال 25OD الخاصة بهما. جدا أهمية عظيمةللتشخيص ، تتوفر طرق تحليلية يمكنها تحديد شكلي الفيتامين بدقة عالية والسماح بمراقبة المرضى الذين يعانون من اضطرابات فيتامين (د) ، والطرق المستخدمة حتى الآن لم تسمح بتحديد منفصل لفيتامين D2 و D3. بالإضافة إلى ذلك ، في التركيزات العالية من فيتامين D2 ، يتم التقليل من كمية D3 التي يمكن اكتشافها. عيب آخر هو استخدام النظائر المشعة. جعل استخدام طريقة HPLC / MS / MS من الممكن ليس فقط تجنب استخدام النظائر المشعة ، ولكن أيضًا لإجراء تحديد منفصل لكليهما. أشكال نشطةفيتامين أ.

الطريقة قابلة للتطبيق على المرضى التالية:
1. إذا كنت تشك في وجود نسبة منخفضة من فيتامين د في الجسم.
2. في حالة الاشتباه في وجود تأثير سام غير مبرر ؛
3. عند فحص المرضى الذين يخضعون للعلاج لمعرفة نسبة منخفضة من فيتامين د ؛
4. سمح استخدام HPLC / MS / MS بتحديد منفصل لكلا الشكلين أثناء مراقبة المريض.

رابعا. تحديد مثبطات المناعة بواسطة HPLC / MS / MS

بعد زراعة الأعضاء ، يجب تناول مثبطات المناعة طوال الحياة لتجنب الرفض. مع نافذة علاجية ضيقة للغاية وسمية عالية ، تتطلب مثبطات المناعة جرعات فردية لتحقيق أقصى تأثير. لذلك ، من الضروري مراقبة مثبطات المناعة الرئيسية: السيكلوسبورين أ ، والتاكروليموس ، وسيروليموس ، وإيفيروليموس لتعديل جرعة الأدوية لكل مريض على حدة ، اعتمادًا على تركيز الدواء في الدم.

لا تزال المقايسات المناعية تُستخدم لمراقبة هذه الأدوية ، لكن هذه الطرق باهظة الثمن وخصوصياتها ودقتها وقابليتها للتكاثر محدودة. توفي المرضى من جرعات غير مناسبة من مثبطات المناعة بناءً على النتائج التي تم الحصول عليها بالطرق المناعية. حاليًا ، يتم استبدال المقايسات المناعية في المختبرات السريرية بـ HPLC / MS / MS. على سبيل المثال ، في عيادة جامعة ميونيخ ، يتم تحليل حوالي 70 عينة يوميًا لمحتوى sirolimus و cyclosporine A باستخدام نظام HPLC / MS / MS. يتم إجراء جميع عمليات تحضير العينات والتحكم في الأدوات بواسطة شخص واحد. يتحول المختبر أيضًا إلى تحليل tacrolimus بهذه الطريقة.

• تم وصف استخدام HPLC / MS / MS من أجل التحديد الروتيني المتزامن لـ tacrolimus و sirolimus و ascomycin و demethoxysirolimus و cyclosporin A و cyclosporin G في الدم. النطاق المحدد بالتركيز هو 1.0 - 80.0 نانوغرام / مل. للسيكلوسبورين 25-2000 نانوغرام / مل. تم تحليل أكثر من 50000 عينة في المختبر خلال العام.
• منذ أن وجد أن الاستخدام المتزامن لـ tacrolimus و sirolimus يعطي تأثيرًا علاجيًا إيجابيًا ، تم تطوير طريقة HPLC / MS / MS بسيطة وفعالة لتحديدها بشكل منفصل في الدم للمقايسات السريرية. يستغرق تحليل عينة واحدة 2.5 دقيقة بدقة 2.46٪ - 7.04٪ للتاكروليموس و 5.22٪ - 8.30٪ لسيروليمس لكامل المنحنى التحليلي. الحد الأدنى للكشف عن tacrolimus هو 0.52 نانوغرام / مل ، سيروليموس 0.47 نانوغرام / مل.

V. تحديد الهوموسيستين بواسطة HPLC / MS / MS

يهتم الهوموسيستين بأمراض القلب والأوعية الدموية (الجلطات الدموية وأمراض القلب وتصلب الشرايين) والحالات السريرية الأخرى (الاكتئاب ومرض الزهايمر وهشاشة العظام ومضاعفات الحمل وما إلى ذلك). تعتبر الطرق الحالية لتحليل الهموسيستين ، بما في ذلك المقايسة المناعية ، باهظة الثمن. تم تطوير طريقة HPLC / MS / MS سريعة لتحليل الهوموسيستين للاستخدام السريري الروتيني في تحليل عدد كبير من العينات. تم إجراء التأين بواسطة طريقة الرش الكهربائي. الطريقة قابلة للتكرار ومحددة للغاية ودقيقة. تتمثل مزايا الطريقة أيضًا في انخفاض تكلفة الكواشف وبساطة تحضير العينة. من الممكن تحليل 500 عينة أو أكثر في اليوم.

استنتاج

وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من استخدام طرق المقايسة المناعية المحسنة بشكل كبير حاليًا ، نظرًا للقيود الأساسية التقنية ، فإن هذه الطريقة لن تكون لها دقة وخصوصية قابلة للمقارنة مع المادة المستهدفة مقارنة بـ HPLC-MSMS ، خاصة في وجود المستقلبات. هذا لا يؤدي فقط إلى دقة منخفضة لطريقة ELISA ونسبة عالية من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة ، ولكنه أيضًا لا يسمح بمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في الأقسام السريرية المختلفة باستخدام طريقة ELISA. يزيل استخدام HPLC-MS / MS هذا العيب ، مما يسمح بإجراء تحليل عالي الدقة ودقيق وسريع لعدد كبير من العينات مع موثوقية عالية في وجود المستقلبات وغياب التداخل من المواد المصاحبة والداخلية في بلازما ودم المرضى.

على الرغم من التكلفة العالية الواضحة لمجمع الأدوات ، كما تظهر الممارسة العالمية ، مع التشغيل السليم ، فإن هذا المجمع يؤتي ثماره في 1-2 سنوات. هذا يرجع في المقام الأول إلى التكلفة المنخفضة لتحليل واحد بسبب التحليل المتزامن لعشرات ومئات المركبات وغياب الحاجة إلى شراء مجموعات تشخيص باهظة الثمن. بالإضافة إلى ذلك ، لدى المختبر الفرصة لتطوير أي طرق تحليل ضرورية بشكل مستقل وعدم الاعتماد على الشركة المصنعة للمجموعات.

اختيار التكوين الصحيح للأجهزة

موجود عدد كبير من أساليب مختلفةمطياف الكتلة وأنواع أجهزة قياس الطيف الكتلي المصممة لحل مجموعة متنوعة من المشكلات - بدءًا من التحديد الهيكلي لجزيئات البروتين المعقدة التي تزن مئات الآلاف من دالتون إلى التحليل الكمي الروتيني عالي الأداء للجزيئات الصغيرة.

لحل المهمة بنجاح ، فإن أحد الشروط الرئيسية هو اختيار النوع الصحيح من المعدات. لا توجد أداة عالمية يمكنها حل النطاق الكامل للمشكلات التحليلية. وبالتالي ، فإن الجهاز المصمم لحل مشكلة تحديد الكائنات الحية الدقيقة غير قادر على إجراء تحليل كمي للجزيئات الصغيرة. والعكس صحيح. الحقيقة هي أنه على الرغم من الاسم الشائع ، فهو بالتأكيد أجهزة مختلفةتعمل على مبادئ فيزيائية مختلفة. في الحالة الأولى ، هذا هو مطياف الكتلة وقت الرحلة مع مصدر تأين بالليزر - MALDI-TOF ، وفي الحالة الثانية - رباعي الأقطاب ثلاثي مع تأين بالرش الكهربائي - HPLC-MSMS.

العامل الثاني الأكثر أهمية هو اختيار التكوين الصحيح للنظام. هناك العديد من الشركات المصنعة الكبرى لمعدات قياس الطيف الكتلي. لا تتمتع أجهزة كل مصنع بنقاط قوتها فحسب ، بل تتميز أيضًا بنقاط ضعفها ، والتي يفضلون عادةً التزام الصمت بشأنها. ينتج كل مصنع خط الأجهزة الخاص به. تتراوح تكلفة مجمع تحليلي واحد بين 100،000 دولار و 1،000،000 دولار أو أكثر. لن يؤدي اختيار أفضل مصنع والتكوين المناسب للمعدات إلى توفير موارد مالية كبيرة فحسب ، بل سيؤدي أيضًا إلى حل المشكلة بشكل أكثر كفاءة. لسوء الحظ ، هناك العديد من الأمثلة حيث تم تنفيذ معدات المختبر دون أخذ هذه العوامل في الاعتبار. والنتيجة هي معدات معطلة ، وأموال ضائعة.

العامل الثالث الذي يحدد التشغيل الناجح للمختبر هو طاقم العمل. تتطلب أجهزة قياس الطيف الكتلي موظفين مؤهلين تأهيلاً عالياً. لسوء الحظ ، لا يوجد لدى أي جامعة في روسيا مقرر دراسي حول قياس الطيف الكتلي العملي الحديث ، لا سيما فيما يتعلق بالتطبيقات السريرية ، ويجب حل مهام تدريب موظفي كل مختبر بمفردهم. بطبيعة الحال ، فإن 2-3 أيام من التدريب التعريفي الذي أجرته الشركة المصنعة بعد إطلاق الجهاز لا يكفي على الإطلاق لفهم أساسيات الطريقة واكتساب المهارات في العمل مع الجهاز.

العامل الرابع هو عدم وجود طرق جاهزة للتحليل. لكل مختبر مهامه ذات الأولوية ، والتي من الضروري حلها لتطوير طريقته الخاصة. يمكن القيام بذلك من قبل شخص لديه خبرة في العمل على الجهاز لمدة 2-3 سنوات على الأقل. يقدم المصنعون أحيانًا طريقة أو طريقتين عامتين ذات طبيعة توصية ، لكن لا يكيّفهم مع مهام معملية محددة.

في بيوفارم إكسبيرت ذ م مهم محترفون يتمتعون بخبرة سنوات عديدة في أنواع مختلفةمطياف الكتلة ، وكذلك تطوير الأساليب وصياغة تحليلات عالية الإنتاجية. لذلك نقدم الخدمات التالية:

1. اختيار التكوين الأمثل للأداة لمهام محددة للعملاء.
2. شراء وتسليم وإطلاق المعدات من الشركات المصنعة الرائدة لمقاييس الطيف الكتلي الترادفي.تدريب الأفراد على مراحل في غضون عام من تاريخ إطلاق المعدات.
3. مجموعة من الأساليب وقواعد البيانات الجاهزة لحل المشكلات السريرية الأساسية.
4. تطوير طرق التحليل وحل مهام محددة للعميل في معمله بمشاركة موظفيه.
5. الدعم المنهجي في جميع مراحل العمل.