Uporaba WLHMS pri analizi snovi. Sodobni problemi znanosti in izobraževanja. Primeri uporabe tekočinske kromatografije v kombinaciji s tandemsko masno spektrometrijo v kliničnih testih

Ključne besede

opomba znanstveni članek o veterinarskih vedah, avtor znanstvenega dela - Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

Vpliv antropogenih dejavnikov ima večplasten učinek na človeško telo in živali. V povezavi z njihovim kompleksnim vplivom je ugotavljanje negativnih učinkov posameznih dejavnikov precej težka naloga. Metabolomična metodologija, ki omogoča premagovanje teh težav, je bila uporabljena pri ocenjevanju narave in stopnje vpliva odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil na lipidne profile poskusnih živali med intranazalnim vnosom odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil. in porabo pitna voda pridobljeno iz virov, ki se nahajajo na potencialnem območju proizvodnje pepelike. Izolacija lipidov iz seruma je bila izvedena s posebej razvito tehniko, ki temelji na ekstrakciji na trdni fazi, kar omogoča odstranitev holesterola iz vzorcev. Vsak vzorec smo analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z masno spektrometrično detekcijo (HPLC-MS), nato pa smo nastale kromatograme obdelali z metodo glavnih komponent (PCA) in analizo grozdov. Razvita tehnika omogoča učinkovito ločevanje hidrofobnih metabolitov v krvnem serumu. Določen je bil lipidni profil krvnega seruma poskusnih živali, predvsem vsebnost fosfolipidov in oksisteroidov, ter razlike v presnovnih procesih med poskusnimi in kontrolnimi živalmi. V krvnem serumu poskusnih živali je bila koncentracija oksisteroidov povečana v primerjavi s kontrolno skupino.

Sorodne teme znanstveni članki v veterini, avtor znanstvenega dela - Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

• Odziv organelov hepatocitov jeter podgan na vpliv amplitudno moduliranega magnetnega polja industrijske frekvence

  2014 / Belkin Anatolij Dmitrijevič, Mičurina Svetlana Viktorovna

• Masno-selektivna identifikacija hormonskih pripravkov v surovem mesu. Analiza ß-agonistov

  2016 / Kulikovski A.V., Kuznecova O.A., Ivankin A.N.

• Uporaba tekočinske kromatografije visoke ločljivosti za določanje ubikinona v vodnih organizmih

  2003 / Rybin V. G.

• Določanje N7--etil]-gvanina v urinu podgan kot označevalca izpostavljenosti žveplovemu ipritu

  2017 / Orlova Olga Igorevna, Karakašev Georgij Vasiljevič, Šmurak Vladimir Igorevič, Abzianidze Viktorija Vladimirovna, Saveljeva Elena Igorevna

• Razvoj metode HPLC-MS za analizo ursodeoksiholne kisline na način detekcije pozitivno nabitih ionov

  2013 / Ilya Aleksandrovich Krasnov, D. E. Bobkov, M. Zaitseva, S. S. Prisyach, N. V. Krasnov

• Razvoj tehnologije za ustvarjanje nove generacije testnih sistemov na osnovi trombodefenzinov za ekspresno diagnostiko infekcijskih in vnetnih bolezni

  2015 / Ivanov Jurij Borisovič, Vasilčenko Aleksej Sergejevič

• Postopek za sočasno določanje karbamazepina in karbamazepin-10,11-epoksida s HPLC-MS/MS

  2015 / Rodina T.A., Melnikov E.S., Sokolov A.V., Prokofjev A.B., Arhipov V.V., Adamov G.V., Pozdnjakov D.L., Olefir Yu.V.

• Sestava maščobnih kislin in steroidov rastlinskih olj

  2006 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Dychko K. A., Kuryaeva T. T.

• Razvoj in validacija metode za določanje gidazepama v biološkem materialu s kromatomasno spektrometrijo

  2015 / A.V. Čubenko, M.A. Savčenko

• Določanje ciklosporina a v krvnem serumu za terapevtsko spremljanje zdravil

  2008 / Fedorova G. A., Podolskaya E. P., Novikov A. V., Lyutvinsky Ya. I., Krasnov N. V.

ANALIZA SERUMSKIH LIPIDNIH PROFILOV PRI MORSKIH PRAŠIČKIH ZA ZGODNJE ODKRIVANJE SPREMEMB V METABOLIZMU POD IZPOSTAVLJENOSTJO ONESNAŽEVALOM OKOLJA

Izpostavljenost antropogenim dejavnikom ima večplasten vpliv na telo ljudi in živali. Zaradi njihovega kompleksnega vpliva je odkrivanje negativnih učinkov določenih dejavnikov precej zapletena naloga. Metabolomska metodologija, ki omogoča premagovanje teh težav, je bila uporabljena pri vrednotenju narave in stopnje vpliva odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil na lipidne profile poskusnih živali po intranazalni inokulaciji z odpadki iz proizvodnje kalijevih gnojil in porabi pitne vode, pridobljene iz virov. ki se nahaja v območju potencialnega delovanja proizvodnje kalijevih gnojil. Izolacijo lipidov iz seruma smo izvedli s pomočjo posebej razvite tehnike, ki temelji na trdnofazni ekstrakciji vzorcev, ki omogoča odstranitev holesterola iz vzorcev. Vsak vzorec smo podvrgli HPLC-MS analizi, nato pa dobljene kromatograme obdelali z metodo analize glavnih komponent in analize grozdov. Razvita tehnika omogoča učinkovito ločevanje hidrofobnih metabolitov v krvnem serumu. Določen je bil serumski lipidni profil poskusnih živali, predvsem vsebnost fosfolipidov in oksisteroidov, ugotovljene pa so bile tudi razlike v presnovnih procesih testnih in kontrolnih živali. Dokazano je, da je v serumu poskusnih živali opaziti povečano koncentracijo hidroksisteroida v primerjavi s kontrolno skupino.

Besedilo znanstvenega dela na temo "Metoda WLC-MS za analizo lipidnih profilov krvnega seruma morskih prašičkov za odkrivanje zgodnjih sprememb v metabolizmu pri izpostavljenosti onesnaževalom iz okolja"

[hijena in sanitarije 3/2014

Chakhovskiy P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

HPLC-MS-METODA ZA ANALIZO LIPIDNIH PROFILOV KRVNEGA SERUMA

morskih prašičkov za odkrivanje zgodnjih presnovnih sprememb, ko so izpostavljeni onesnaževalom okolju

TU "Republiški znanstveni in praktični center za higieno", 220012, Minsk, Republika Belorusija; ^Inštitut za bioorgansko kemijo Nacionalne akademije znanosti Belorusije, 220141, Minsk, Republika Belorusija

Vpliv antropogenih dejavnikov ima večplasten učinek na človeško telo in živali. V povezavi z njihovim kompleksnim vplivom je ugotavljanje negativnih učinkov posameznih dejavnikov precej težka naloga. Za oceno narave in obsega vpliva odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil na lipidne profile poskusnih živali pri intranazalnem sejanju z odpadki iz proizvodnje kalijevih gnojil smo uporabili metabolomično metodologijo, ki omogoča premagovanje teh težav. in poraba pitne vode, pridobljene iz virov, ki se nahajajo na območju potencialne proizvodnje pepelike. Izolacija lipidov iz seruma je bila izvedena s posebej razvito tehniko, ki temelji na ekstrakciji na trdni fazi, kar omogoča odstranitev holesterola iz vzorcev. Vsak vzorec smo analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z masno spektrometrično detekcijo (HPLC-MS), nato pa smo nastale kromatograme obdelali z metodo glavnih komponent (PCA) in analizo grozdov. Razvita tehnika omogoča učinkovito ločevanje hidrofobnih metabolitov v krvnem serumu. Določen je bil lipidni profil krvnega seruma poskusnih živali, predvsem vsebnost fosfolipidov in oksisteroidov, ter razlike v presnovnih procesih med poskusnimi in kontrolnimi živalmi. V krvnem serumu poskusnih živali je bila koncentracija oksisteroidov povečana v primerjavi s kontrolno skupino.

Ključne besede: steroidi; lipidi; krvni serum; presnovni profil; industrijski odpadki.

P. A. Chakhovskiy1, A. V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALIZA SERUMSKIH LIPIDNIH PROFILOV PRI MORSKIH PRAŠIČKIH ZA ZGODNJE ODKRIVANJE SPREMEMB V METABOLIZMU POD IZPOSTAVLJENOSTJO ONESNAŽEVALOM IZ OKOLJA

1Republiški znanstveni in praktični center za higieno, Minsk, Republika Belorusija, 220012; 2Inštitut za bioorgansko kemijo, Minsk, Republika Belorusija, 220141

Za korespondenco: Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, [e-pošta zaščitena]. com

Izpostavljenost antropogenim dejavnikom ima večplasten vpliv na telo ljudi in živali. Zaradi njihovega kompleksnega vpliva je odkrivanje negativnih učinkov določenih dejavnikov precej zapletena naloga. Metabolomska metodologija, ki omogoča premagovanje teh težav, je bila uporabljena pri vrednotenju narave in stopnje vpliva odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil na lipidne profile poskusnih živali po intranazalni inokulaciji z odpadki iz proizvodnje kalijevih gnojil in porabi pitne vode, pridobljene iz lociranih virov. v območju potencialnega delovanja proizvodnje kalijevih gnojil. Izolacijo lipidov iz seruma smo izvedli s pomočjo posebej razvite tehnike, ki temelji na trdnofazni ekstrakciji vzorcev, ki omogoča odstranitev holesterola iz vzorcev. Vsak vzorec smo podvrgli HPLC-MS analizi, nato pa smo dobljene kromatograme obdelali z metodo analize glavnih komponent in analize grozdov. Razvita tehnika omogoča učinkovito ločevanje hidrofobnih metabolitov v krvnem serumu. Določen je bil serumski lipidni profil poskusnih živali, predvsem vsebnost fosfolipidov in oksisteroidov, ugotovljene pa so bile tudi razlike v presnovnih procesih testnih in kontrolnih živali. Dokazano je, da je v serumu poskusnih živali opaziti povečano koncentracijo hidroksisteroida v primerjavi s kontrolno skupino.

Ključne besede: steroidi, lipidi, krvni serum, presnovni profil, industrijski odpadki.

Uvod

Ena najpomembnejših nalog sistemske biologije in funkcionalne genetike je integracija proteomike, transkriptomike in informacij o presnovnih procesih, ki potekajo v telesu. Vsaka bolezen ali patološki proces, ki se pojavi v telesu, se odraža v vsebnosti metabolitov z nizko molekulsko maso v tkivih in krvi. Leta 1971 je bil uveden izraz "presnovni profil" za celovito karakterizacijo metabolitov z nizko molekulsko maso krvne plazme. Ker je hkratna analiza več razredov presnovkov izjemno zapletena in praktično nerealna, se za preučevanje presnovnih profilov običajno uporablja vrsta metod, vključno z visokoločljivo spektroskopijo jedrske magnetne resonance (NMR) in kromato-masno spektrometrijo.

Praviloma so metabolomične študije omejene na določeno skupino snovi, ki so med pripravo vzorca ločene od drugih komponent. Dobljene skupinske podatke je lažje interpretirati.

Profile presnove (zlasti urina in krvne plazme) je mogoče uporabiti za določitev narave fizioloških sprememb, ki jih povzroča vnos strupenih spojin v telo. V mnogih primerih lahko opažene spremembe zagotovijo dodatno karakterizacijo specifičnih lezij, kot so jetra in maščobno tkivo.

Velik diagnostični potencial ima analiza vsebnosti steroidov in lipidov v krvnem serumu. Lipidna sestava krvnega seruma, steroidni hormoni, njihovi prekurzorji in produkti njihove presnovne transformacije označujejo številne funkcionalne parametre telesa. Te snovi imajo pomembno koordinacijsko vlogo pri uravnavanju presnove in delovanja srca in ožilja ter sodelujejo pri odzivu telesa na akutni in kronični stres.

Steroidni profil je edinstven diagnostični kriterij za številne ginekološke in onkološke bolezni povezane z moteno sintezo in presnovo steroidnih hormonov, nekatere od njih pa lahko diagnosticiramo le s steroidnim profilom. Pri analizi profila je zelo pomembna možnost uporabe absolutnih vrednosti kot preprostih spremenljivk in njihove primerjave z normo. Vendar pa je morda pomembnejša sprememba razmerja magnitud. Poleg tega steroidni profil zagotavlja informacije o velikem številu steroidov hkrati.

Določitev steroidnega profila krvnega seruma - učinkovita metoda odkrivanje skoraj vseh motenj presnove steroidov, kar vam omogoča, da postavite

natančno diagnozo v številnih kliničnih situacijah, na primer pri prirojeni hiperplaziji nadledvične žleze, hiperaldosteronizmu tipa I, primarnem hiperaldosteronizmu, Itsenko-Cushingovi bolezni, insuficienci nadledvične žleze itd. Steroidni profil je pomemben pri diagnostiki motenj spolne diferenciacije in delovanja spola žlez, kot tudi hipotalamus hipofizno-nadledvična insuficienca.

Prekomerni vnos soli, ki je prevladujoča sestavina odpadkov kalijevih gnojil, v telesu poskusnih podgan s prekomerno telesno težo vodi do čezmerne aktivacije sinteze aldosterona in povzroča hipertenzijo in okvaro ledvic z metaboličnim sindromom.

V regijah industrijske proizvodnje z visoko stopnjo onesnaženosti okolja je stopnja pojavnosti prebivalstva običajno višja kot v razmeroma "čistih" regijah. Predmet naše raziskave je bilo mesto Soligorsk, ki se nahaja na območju obsežnega rudarjenja in predelave kalijevih rud. Na območjih odlagališč soli in skladišč pepelike se je oblikovalo območje zasoljevanja z natrijevim kloridom, ki pokriva podtalnico do globine več kot 100 m, kar lahko vpliva na onesnaženje virov oskrbe s pitno vodo in atmosferskega zraka.

Za oceno vpliva onesnaženosti posameznih sestavin okolja na območju industrijske proizvodnje kalijevih gnojil smo analizirali lipidne profile krvnega seruma kot indikatorja zgodnjih presnovnih motenj pod vplivom mešanice kemikalij.

Namen dela je s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z masno spektrometrično detekcijo (HPLC-MS) identificirati presnovne spremembe pri laboratorijskih živalih med izpostavljenostjo proizvodnim odpadkom pepelike in uživanju pitne vode, pridobljene iz virov, na katere potencialno vplivajo proizvodni odpadki.

Predmet raziskave je bil krvni serum poskusnih živali (morskih prašičkov) poskusne in kontrolne skupine.

Materiali in metode

Eksperimentalne študije so bile izvedene na 35 morskih prašičkih (17 samic in 18 samcev) s težo 305-347 g.

[hijena in sanitarije 3/2014

Eksperimentalna skupina (semena z odpadki iz industrijske proizvodnje kalijevih gnojil in pitna voda iz vodovodnega sistema Soligorsk), 20 posameznikov (10 žensk in 10 moških);

Kontrolna skupina (primiranje z izotonično raztopino natrijevega klorida za odpravo učinkov stresnega faktorja, ki ga povzroča postopek priprave), 15 posameznikov (8 samcev in 7 samic).

Med poskusom so potekala dnevna opazovanja splošno stanježivali, poraba hrane in vode.

Za simulacijo kronične inhalacijske izpostavljenosti (12 tednov) odpadkov iz proizvodnje kalijevih gnojil, MU. št. 11-11-10-2002 "Zahteve za organizacijo toksikoloških in alergoloških študij med higiensko ureditvijo aerosolov, ki vsebujejo beljakovine, v zraku delovnega območja", vključno z določitvijo odmerka semena. Vzorce iz odlagališč soli smo zmleli v marmorni terilnici do homogenega praškastega stanja, raztopili v destilirani vodi do želene koncentracije, upoštevajoč telesno težo poskusnih živali (telesno težo smo spremljali tedensko za prilagoditev odmerka). Izračunani odmerki so bili: na začetku poskusa - 2,028 mg / 0,1 cm3, po 4 tednih - 2,85 mg / 0,1 cm3, po 6 tednih - 3,17 mg / 0,1 cm3, po 8 tednih in do konca poskusa 3,8 mg / 0,1 cm3.

Morski prašiček brez anestezije je bil pritrjen v ležečem položaju z dvignjeno glavo, odmerek tople raztopine je bil izmenično vbrizgan v nosnice (delno) (v 2-3 minutah) s pipetnim razpršilnikom tako, da je izključeno kihanje. Nastali "škripajoči" zvoki so potrdili prodor raztopine v dihalne poti.

Eksperimentalna skupina živali je 12 tednov vsak dan enkrat 5 dni v tednu »inhalirala« mešanico. Živali kontrolne skupine so "inhalirale" fiziološko raztopino (0,9% NaCl).

Za izbor biološkega materiala so bile živali anestezirane (eterna anestezija), po dekapitaciji je bila zbrana kri. Serum smo pridobili s centrifugiranjem pri 3000 obratih na minuto 15 minut in shranili pri -20 C za nadaljnje študije. V krvnem serumu smo analizirali fosfolipide, oksisteroide in maščobne kisline.

Priprava vzorca. Krvnemu serumu smo dodajali interni standard, progesteron, dokler nismo dosegli koncentracije 10–5 M (10 μl na 1 ml vzorca). Nato smo za oborjenje beljakovin v vzorcu in ekstrahiranje steroidov dodali metanol do končne koncentracije 70% (2,33 ml metanola na 1 ml vzorca), čemur je sledilo centrifugiranje 15 minut pri 10.000 g. Beljakovine v vzorcu so tvorile gosto oborino. Supernatant smo ločili od pelete in ga spustili skozi predkondicionirano kolono za ekstrakcijo v trdni fazi (SPE), ki je vsebovala 100 mg oktadecilsilil silikagela. SFE kolono smo kondicionirali z zaporednim prehodom 2 ml metanola, 2 ml vode in 2 ml 70 % metanola. V prvi fazi je na kolono vezan holesterol, katerega vsebnost v krvni plazmi in drugih bioloških tekočinah je precej visoka, ter številni drugi visoko hidrofobni lipidi. Po vezavi holesterola smo kolono nadalje sprali z 2 ml 70 % metanola. Pri visoki vsebnosti holesterola v vzorcu ali velikem volumnu vzorca uporabite

uporabljali kolono TFE z visoko vsebnostjo sorbenta. Eluate smo združili in uparili. Uparjanje je potekalo pri 50 °C v curku inertnega plina. Suh ostanek smo raztopili v 500 µl metanola in centrifugirali 10 minut pri 10.000 g. V tem primeru so se oborile polarne, v metanolu netopne spojine. Supernanant smo ločili od oborine in razredčili z vodo do koncentracije metanola 10 %. Nastalo raztopino spustimo skozi predkondicionirano TFE kolono (prepustimo 2 ml metanola, 2 ml vode in 2 ml 10 % metanola) in speremo z 2 ml 10 % metanola. Steroide, vezane na kolono, smo eluirali s 3 ml 80 % metanola. Raztopino smo uparili in suh ostanek raztopili v 100 μl metanola. Nastalo raztopino smo analizirali s HPLC-MS.

HPLC analiza. Analiza je bila izvedena na kromatografu Accela, opremljenem z masnim spektrometričnim detektorjem LCQ-Fleet. Ločevanje je bilo izvedeno na koloni Cosmosil 5C18-MS-II z geometrijskimi parametri 4,6 x 150 mm (Nacalai Tesque, Japonska).

Program ločevanja (topilo A - voda, topilo B - metanol, pretok 500 μl / min): 5 min 60% B, 12 min - linearni gradient 60-95% B, 10 min - 95% B, 8 min - linearni gradient 95-100% B, 5 min - 100% B, 5 min - 60% B.

Za masno spektrometrično analizo je bil uporabljen vir kemične ionizacije zračni tlak(APCI). Parametri ionizacijskega vira: temperatura uparjalnika - 350°C, pretok sušilnega plina - 35 enot, pretok pomožnega plina - 5 enot, temperatura kapilare - 275°C, kapilarna napetost - 18 V, napetost na ionskem objektivu - 80 V. Uporabljeni podatki- odvisen način skeniranja (Data Dependent™) z uporabo ionske pasti v območju skeniranja 50–1000 m/z.

Kromatograme, dobljene z masnim spektrometričnim detektorjem v načinu kemijske ionizacije (celotni ionski tok), smo pretvorili v besedilno obliko s programom Qual Browser iz paketa Xcalibur (Thermo Sci, ZDA). Pridobljene informacije so bile obdelane z uporabo metode glavnih komponent implementirane v paketu Statistica 10 in orodij za analizo grozdov in gradnjo dendrogramov. Za interpretacijo masnih spektrov in identifikacijo posameznih spojin je bil uporabljen priročnik.

Rezultati in razprava

Kot začetno metodo za prilagoditev je bila uporabljena metoda trdnofazne ekstrakcije steroidov iz seruma in krvne plazme, opisana v priročniku podjetja "Macherey-Nagel" Solidphase Extraction. Priročnik za uporabo, ki vsebuje priporočila za uporabo stolpcev SPE. Prilagojena tehnika priprave vzorcev s trdno fazno ekstrakcijo je omogočila učinkovito izolacijo fosfolipidov, hidroksisteroidov in maščobnih kislin iz krvnega seruma morskih prašičkov.

Opisana tehnika kromatografskega ločevanja omogoča učinkovito ločevanje tako steroidnih hormonov kot serumskih lipidov.

Vzorce smo analizirali po opisanih metodah. Na sl. 1 (glej 2. naslovno stran) so za primer prikazani prekriti kromatogrami, pridobljeni z analizo 3 vzorcev iz poskusne skupine (označeno

riž. Sl. 4. Masni spektri snovi z retenzijskim časom 21,5 min: a - kemična ionizacija pri atmosferskem tlaku v negativnem načinu; b - kemična ionizacija pri atmosferskem tlaku v pozitivnem načinu.

rdeče) in 3 vzorci iz kontrolne skupine (označeni modro). Podoben vzorec so opazili tudi v drugih primerih.

Za obdelavo teh nizov podatkov smo uporabili metodo glavne komponente (PCA) in analizo grozdov, ki sta omogočili ugotavljanje razlik v lipidnih profilih med kontrolno in eksperimentalno skupino. Dobljeni PCA-graf 1. in 2. glavne komponente

ko je dimenzija podatkov zmanjšana, je prikazano na sl. 2 (glej 2. naslovnico). Na grafu je enostavno videti, da so točke združene v 2 skupini, ki se nahajata v 1., 4. in 2., 3. kvadrantu. V tem primeru točke, ki ustrezajo eksperimentalnim vzorcem, večinoma spadajo v 1. in 4. kvadrant, točke, ki ustrezajo kontrolnim vzorcem, so lokalizirane v 2. in 3. kvadrantu. Dendrogram, pridobljen z

[hijena in sanitarije 3/2014

Identifikacija vrhov, prisotnih v kromatogramu

Retencijski čas, min Glavni vrhovi v načinu "+" Glavni vrhovi v načinu "-".

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Snov

Fosfatidilholin

Arahinska kislina

Fosfatna kislina 42:4

Arahična in dokozat-traenojska kislina

Dokozapentaenoična

Linolna kislina

Dihidroksiholesterol

analiza krme je prikazana na sl. 3. Tako statistična analiza kromatografskih podatkov kaže na razlike v presnovnih procesih, ki se pojavljajo v organizmih poskusnih živali iz kontrolne in poskusne skupine.

Za identifikacijo specifičnih presnovnih sprememb so bili masni spektri dešifrirani in identificirani

posamezne spojine so navedene (glej tabelo). Nezadostna količina vzorca za analizo ni omogočila odkrivanja sprememb v profilu steroidnih hormonov v serumu. Vendar so bili na kromatogramu odkriti lipidi z vmesno polarnostjo.

Posamezne spojine smo identificirali z analizo masnih spektrov snovi, posnetih pri različnih načinih ionizacije. Tako je masni spekter snovi v dveh načinih ionizacije z retencijskim časom 21, 5 min prikazan na sl. 4. Analiza tega spektra je pokazala, da je snov diacil-sn-glicerofosfat z molekulsko maso 780 (R1(311) = 20:0 maščobna kislina (arahidna), R2(331) = 22:4 maščobna kislina (dokozatetraenojska) ).

Ugotovljeno je bilo, da kromatografski vrh z retenzijskim časom 42,52 min ustreza dihidroksiholesterolu, domnevno enemu od prekurzorjev v biosintezi žolčnih kislin. Razlike v vsebnosti oksisteroidov v krvnem serumu kažejo na možno kršitev presnove žolčnih kislin. Vidimo, da so kromatogrami, prikazani na sl. 1, v krvnem serumu poskusnih živali je povečana koncentracija oksisteroidov v primerjavi s kontrolo (vrhovi z retencijskim časom 35-45 minut).

sklep. Tehnika, uporabljena pri delu, omogoča odkrivanje zgodnjih motenj metabolizma lipidov pod vplivom okoljskih onesnaževal z visoko stopnjo učinkovitosti. Dobljeni rezultati kažejo, da intranazalno dajanje vodnih raztopin deponij soli poskusnim živalim Cavia porcellus povzroči spremembo presnove lipidov in oksisteroidov. Zlasti opažena povišana vsebnost prekurzorjev žolčnih kislin (hidroksisteroidov) pri živalih je lahko povezana z okvarjenim delovanjem jeter in encimov, ki sodelujejo pri biosintezi žolčnih kislin. Tako lahko opisani pristop uporabimo za odkrivanje motenj metabolizma lipidov pri prebivalcih regij s tehnogenim onesnaženjem.

Literatura

1. Horning E.C., Horning M.G. Presnovni profili: plinskofazne metode za analizo metabolitov. Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Uporaba metabonomike na osnovi NMR pri preiskavi miokardne ishemije-reperfuzije, ishemične predkondicioniranja in antioksidativne intervencije pri kuncih. EUR. J Pharm. sci. 2007; 30 (3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analitične strategije za ciljano metabolomiko na osnovi LC-MS. J Chromatogr. B. Analitik. Technol. Biomed. življenje sci. 2008; 871 (2): 236-42.

4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. Bioindividualchemicality se odraža v kromatografskih, elektroforetskih in masnospektrometričnih profilih. J Chromatogr. B. Analitik. Technol. Biomed. življenje sci. 2008; 866 (1-2): 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Živković A.M., Watkins S.M. Lipidomika in profiliranje lipidov v metabolomiki. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18 (1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Uporaba steroidnega profiliranja z UPLC-MS/MS kot testa druge stopnje pri presejanju novorojenčkov za prirojeno adrenalno hiperplazijo: izkušnja iz Utaha. Pediatr. Res. 2009; 66 (2): 230-5.

7. Rauh M. Merjenje steroidov z LC-MS/MS. Aplikacija

K čl. Chakhovsky et al.

riž. 3. Dendrogram, sestavljen na podlagi klastrske analize, ki ponazarja združevanje vzorcev po skupinah.

K čl. Chakhovsky et al.

riž. 1. Prekrivajoči se kromatogrami vzorcev 1-3 iz kontrolne skupine (označeno z rdečo) in 15-17 iz poskusne skupine (poudarjeno z modro).

Projekcija primerov na faktorsko ravnino (1 x 2) Primeri z vsoto kosinusa kvadrata >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 izposoja "Sh o 28/1" 22/10 41 /1 str

Faktor 1: 65,71 %

riž. 2. Graf, dobljen z obdelavo kromatogramov s PCA. Kontrolna skupina je označena z modro, eksperimentalna skupina z rdečo.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je metoda kolonske kromatografije, pri kateri je mobilna faza (MP) tekočina, ki se giblje skozi kromatografsko kolono, napolnjeno s stacionarno fazo (sorbentom). Za kolone HPLC je značilen visok hidravlični tlak na vstopu v kolono, zato se HPLC včasih imenuje tudi "High Pressure Liquid Chromatography".

Glede na mehanizem ločevanja snovi ločimo naslednje različice HPLC: adsorpcijsko, distribucijsko, ionsko izmenjevalno, izključitveno, kiralno itd.

Pri adsorpcijski kromatografiji pride do ločevanja snovi zaradi njihove različne sposobnosti adsorpcije in desorpcije s površine adsorbenta z razvito površino, na primer silikagela.

Pri razdelilni HPLC pride do ločevanja zaradi razlike v porazdelitvenih koeficientih snovi, ki jih je treba ločiti, med stacionarno (praviloma kemično cepljeno na površino nepremične podlage) in mobilno fazo.

Po polarnosti PF in NF HPLC delimo na normalno fazo in reverzno fazo.

Normalnofazna kromatografija je različica kromatografije, ki uporablja polarni sorbent (na primer silikagel ali silikagel s cepljenimi skupinami NH 2 - ali CN) in nepolarni PF (na primer heksan z različnimi dodatki). Pri reverzno fazni kromatografiji se uporabljajo nepolarni kemično modificirani sorbenti (npr. nepolarni C 18 alkilni radikal) in polarne mobilne faze (npr. metanol, acetonitril).

Pri ionsko izmenjevalni kromatografiji se molekule snovi zmesi, ki so v raztopini disociirane na katione in anione, ločijo med premikanjem skozi sorbent (kationski izmenjevalec ali anionski izmenjevalec) zaradi različnih menjalnih stopenj z ionskimi skupinami sorbenta. .

Pri velikostno izključitveni (sitni, gel prodorni, gel filtracijski) kromatografiji ločimo molekule snovi po velikosti zaradi njihove različne sposobnosti prodiranja v pore stacionarne faze. V tem primeru kolono prve zapustijo največje molekule (z največjo molekulsko maso), ki lahko prodrejo v minimalno število por stacionarne faze, zadnje pa zapustijo snovi z majhnimi molekulskimi velikostmi.

pogosto ločitev ne poteka z enim, ampak z več mehanizmi hkrati.

Metoda HPLC se lahko uporablja za nadzor kakovosti vseh neplinastih analitov. Za analizo se uporabljajo ustrezni instrumenti - tekočinski kromatografi.

Sestava tekočinskega kromatografa običajno vključuje naslednje glavne komponente:

– enota za pripravo PF, vključno z rezervoarjem z mobilno fazo (ali rezervoarji s posameznimi topili, ki so del mobilne faze) in sistemom za razplinjevanje PF;

– črpalni sistem;

– mešalnik mobilne faze (če je potrebno);

– sistem za vbrizgavanje vzorca (injektor);

– kromatografska kolona (lahko se vgradi v termostat);

– detektor;

– sistem zbiranja in obdelave podatkov.

Črpalni sistem

Črpalke zagotavljajo dovod PF v kolono z dano konstantna hitrost. Sestava mobilne faze je lahko konstantna ali se med analizo spreminja. V prvem primeru se proces imenuje izokratski, v drugem pa gradient. Pred črpalnim sistemom so včasih nameščeni filtri s premerom por 0,45 µm za filtriranje mobilne faze. Sodoben črpalni sistem tekočinskega kromatografa je sestavljen iz ene ali več računalniško vodenih črpalk. To vam omogoča spreminjanje sestave PF v skladu z določenim programom med gradientnim eluiranjem. Mešanje komponent PF v mešalniku lahko poteka tako pri nizkem tlaku (pred črpalkami) kot pri visokem tlaku (po črpalkah). Mešalnik se lahko uporablja za pripravo PF in za izokratsko elucijo, vendar natančnejše razmerje komponent dosežemo s predmešanjem komponent PF za izokratični postopek. Črpalke za analitično HPLC omogočajo vzdrževanje konstantnega pretoka PF v kolono v območju od 0,1 do 10 ml/min pri vstopnem tlaku v kolono do 50 MPa. Priporočljivo pa je, da ta vrednost ne presega 20 MPa. Nizke tlaka so minimizirane s posebnimi sistemi blažilnikov, vključenimi v konstrukcijo črpalk. Delovni deli črpalk so izdelani iz materialov, odpornih proti koroziji, kar omogoča uporabo agresivnih komponent v sestavi PF.

Validirana metoda HPLC-MS/MS je bila razvita za identifikacijo in kvantifikacijo novega aminokislinskega derivata 1,3,4-tiadiazola LHT7-09. Največja občutljivost masne spektrometrične detekcije LHT7-09 je bila dosežena v načinu detekcije pozitivnih ionov pri napetosti elektrospreja 5500 V in potencialu deklasterizacije 36 V. Identificirani prehodi MRM so potrdili kemijsko strukturo novega aminokislinskega derivata 1, 3,4-tiadiazol. Za učinkovito izolacijo LHT7-09 iz večkomponentnih mešanic tiadiazolilamidov je bil razvit gradientni način tekočinske kromatografije visoke ločljivosti z uporabo mešanice acetonitrila in deionizirane vode v različnih razmerjih kot eluenta. Za te kromatografske pogoje je bil retencijski čas spojine LHT7-09 določen na 11 minut. Za kvantitativno določitev spojine LHT7-09 je bila razvita umeritvena raztopina za odvisnost površine kromatografskega vrha od koncentracije raztopine.

whr-ms/ms

kromatografija

masna spektrometrija

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Študija protivnetnega delovanja novih derivatov tiadiazola pri formalinskem edemu šape pri podganah / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Sodobna vprašanja znanost in izobraževanje. - 2013. - št. 3. www..

2. Novi derivati ​​tiadiazola s protiglivičnim delovanjem / A.S. Koshevenko [et al.] // Napredek v medicinski mikologiji. - 2015. - T. 14. - S. 348-351.

3. Sinteza in protitumorska aktivnost novih furil-2-substituiranih 1,3,4-tiadiazolov, 1,2,4-triazolov / T.R. Ovsepyan [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2011. - T. 45. - Št. 12. - Str. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Vrednotenje akutne toksičnosti novega aminokislinskega derivata tiadiazola pri intraperitonealnem dajanju mišim / N.S. Popov, M.A. Demidov // Zgornja Volga zdravniški vestnik. - 2016. - V. 15, št. 1. - S. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Vrednotenje ulcerogenosti novega aminokislinskega derivata tiadiazola pri intragastričnem dajanju podganam / N.S. Popov, M.A. Demidova // Doktorski študent. - 2017. - št. 1 (80). - S. 71-78.

6. Sinteza in protimikrobna aktivnost amidov feniltio- in benzilsulfonocetne kisline na osnovi 2-amino-5-alkil(arilalkil)-1,3,4-tiadiazolov / S.A. Serkov [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2014. - T. 48, št. 1. - S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Sinteza in farmakološka aktivnost derivatov imidazotiadiazola // Acta Poloniae Pharmaceutica, Raziskave zdravil. 2016. letnik 73. št. 4. Str. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Sinteza in protirakavo delovanje novega 1-Thia-4-azaspirodekana, njihovega izpeljanega tiazolopirimidina in 1,3,4-tiadiazolnih tioglikozidov // Molekule. 2017. Št. 22(1). Str. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Soli 5-amino-2-sulfonamid-1,3,4-tiadiazola, strukturnega in analognega acetazolamida, kažejo zanimive inhibitorne lastnosti karboanhidraze, diuretik in antikonvulzivno delovanje // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. letnik 12. št. 6. Str. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Sinteza in protiglivično delovanje spojin 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinona na osnovi dehidroabietične kisline // Molekularna raznolikost. 2016. letnik 20. št. 4. Str. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Sinteza, biološka ocena in študija molekularnega modeliranja novih (1,2,4-triazol ali 1,3,4-tiadiazol)-metiltio-derivatov kinazolin-4(3H)-ona kot inhibitorjev DHFR // Bioorganska kemija. 2017 Vol. 72. Str. 282-292.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z masno spektrometrično detekcijo je ena najbolj obetavnih metod za identifikacijo in kvantifikacijo zdravilne snovi v različnih bioloških objektih. Metodo odlikuje visoka specifičnost, natančnost in možnost določanja substanc v minimalnih koncentracijah, kar omogoča njeno uporabo za kvantitativno določanje zdravil v farmakokinetičnih študijah in monitoringu zdravil, kar je pomembno za klinično laboratorijsko diagnostiko. V ta namen je potrebno razviti in validirati metode za kvantitativno določanje različnih zdravilnih učinkovin, vključno z inovativnimi, ki temeljijo na metodi HPLC-MS/MS.

Originalno zdravilo iz skupine nesteroidnih protivnetnih zdravil je akeksazolamid, nov derivat 1,3,4-tiadiazolamida in aceksamične kisline. Pomembna prednost te spojine je njena nizka toksičnost in nizka ulcerogenost. Za izvedbo farmakokinetičnih študij in ovrednotenje biološke uporabnosti določene zdravilne učinkovine z različnimi načini uporabe je treba razviti zanesljivo metodo za njeno kvantitativno določanje v bioloških tekočinah.

Namen te študije je bil razvoj metodologije za identifikacijo in kvantifikacijo novega nesteroidnega protivnetnega zdravila iz skupine derivatov tiadiazola s HPLC-MS/MS.

Materiali in metode

Predmet študije je bil nov derivat tiadiazola z laboratorijsko oznako LHT 7-09, sintetiziran v JSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) prof. S.Ya. Skachilova (slika 1).

2-(5-etil-1,3,4-tiadiazolil)amid 2-acetilaminoheksanojske kisline

riž. 1. Kemijska struktura LHT 7-09 (bruto formula: C 12 H 20n 4 Približno 2S; molska masa 284,4g/mol)

Povezava LHT 7-09 po videzu je bel prah, ki je praktično netopen v vodi, topen v alkoholu, lahko topen v acetonitrilu.

Za identifikacijo in kvantifikacijo LCT 7-09 je bila uporabljena validirana metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti z masno spektrometrično detekcijo (HPLC-MS/MS).

Kromatografijo smo izvedli s tekočinskim kromatografom visoke ločljivosti Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Nemčija). V študiji je bila uporabljena analitska kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm. Za izolacijo preučevane spojine smo razvili način gradientne kromatografije. Kot eluent smo uporabili acetonitril, deionizirano vodo in amonijev acetat v različnih razmerjih.

Za masno spektrometrijo je bil uporabljen trojni kvadrupolni masni spektrometer ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) z virom ionov v elektrospreju (TurboV s sondo TurboIonSpray). Masni spektrometer smo kalibrirali s testno raztopino rezerpina v koncentraciji 6,1×10 -2 mg/l.

Masno spektrometrično analizo proučevanih vzorcev smo izvedli v elektrosprejnem načinu z neposrednim vbrizgavanjem vzorca in eluata, ki ga dovaja kromatograf. Neposredno vbrizgavanje testnih vzorcev v masni kromatograf smo izvedli s pomočjo brizgalne črpalke premera 4,61 mm s hitrostjo 10 μl/min.

Pri razvoju tehnike za identifikacijo in kvantitativno določanje novega tiadiazolnega derivata so bili izbrani optimalni pogoji za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti in masno detekcijo. Upoštevan je bil čas izstopa snovi iz kromatografske kolone in prehod MRM (registracija je bila izvedena m/z prekurzorski ion na prvem analitičnem kvadrupolu Q1 in m/z produktnih ionov na drugem analitičnem kvadrupolu Q3). Za kvantitativno določitev LHT 7-09 smo zgradili umeritveni graf v koncentracijskem območju od 0,397 do 397 ng/ml.

Kot programska oprema je bila uporabljena programska oprema AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Rezultati in razprava

Na prvi stopnji eksperimentalne študije smo izvedli masno detekcijo testnega vzorca z neposrednim vbrizgavanjem v masni detektor s črpalko za brizgo. V fazi priprave vzorca smo dobili raztopino LHT 7-09 (500 ng/ml) v mešanici acetonitrila in ionizirane vode v razmerju 2:1 z dodatkom amonijevega acetata (0,1%).

Preliminarni poskusi so pokazali, da je bila v načinu zaznavanja pozitivnih ionov občutljivost zaznavanja LCT 7-09 večja, masni spekter pa bolj intenziven in informativen kot v načinu zaznavanja negativnih ionov. V zvezi s tem je bil v nadaljnjih študijah uporabljen samo način pozitivne ionizacije.

Za pridobitev intenzivnega vrha so bili izbrani naslednji pogoji zaznavanja mase: : pozitivna polarizacija, napetost elektrospreja 5500,0 V, potencial razstrupljanja in vhodni potencial 36,0 oziroma 6,5 ​​V pri tlaku zavesnega plina 20,0 psi in razpršilnem plinu 40,0 psi, hitrost 10 µl/min. Območje skeniranja je bilo 270-300 Da.

Analiza dobljenega masnega spektra v prvem analitičnem kvadrupolu Q1 je pokazala, da v teh pogojih zaradi dodatka vodikovega protona nastane protonirana molekula proučevane spojine + z vrednostjo m/ z 285,2 Da (slika 2).

riž. 2. Masni spekter protonirane molekule LHT 7-09 (v načinu skeniranja pozitivnih ionov +)

Na drugem analitičnem kvadrupolu Q3 so bili produktni ioni registrirani za prekurzorski ion z vrednostjo m/z 285,2 Da. Analiza masnega spektra 2. reda je pokazala prisotnost številnih vrhov, od katerih so bili 3 najbolj intenzivni - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da in m/z 75,1 Da (slika 3).

riž. 3. Masni spekter produktnih ionov (v načinu skeniranja pozitivnih ionov, prekurzorski ionm/ z285,2 Da)

Za pridobitev ionskega signala visoke intenzivnosti so bile izbrane optimalne vrednosti energije v kolizijski celici Q2 (upoštevano je bilo območje energije od 0 do 400 V). Za produktne ione z vrednostmi m/ z 114,2 Da, 130,2 Da in 75,1 Da, optimalna energija v udarni celici je bila 27 V; 23 V in 49 V.

Predpostavlja se, da produkt ion z vrednostjo m/ z 114,2 Da je fragment 5-amino-2-etil-1,3,4-tiadiazola, saj fragmentacija drugih derivatov 1,3,4-tiadiazola prav tako razkrije produktni ion z enako vrednostjo m/ z. Ionski izdelek z vrednostjo m/ z 130,2 Da je verjetno protoniran fragment aceksamske kisline. Tako so rezultati množične detekcije proučevanega vzorca potrdili kemijsko zgradbo novega derivata 1,3,4-tiadiazola.

V naslednji fazi eksperimentalne študije smo analizirano spojino analizirali s HPLC-masno spektrometrijo.

V načinu HPLC-MS/MS so bili uporabljeni naslednji ionizacijski pogoji: napetost elektrospreja 5500,0 V, hitrost pretoka mobilne faze 400 µl/min, temperatura dušika 400 °C, tlak zavesnega plina in razpršilnega toka 20,0 oziroma 50,0 psi. Hitrost snemanja posameznih masnih spektrov je bila 100 spektrov na sekundo. Za pridobitev povzetka masnega spektra na kromatogramu je bil dodeljen časovni interval 10,5-11,5 minut; glede na intenziteto signala produktnih ionov so bile izrisane krivulje časovne odvisnosti ionskega toka in površine vrhov posameznih signalov, ki ustrezajo testni spojini. Volumen vzorca, vbrizganega v analitično kolono, je bil 10 μL.

Za izolacijo preučevane spojine smo uporabili gradientni način tekočinske kromatografije visoke ločljivosti, ki smo ga zagotovili s spreminjanjem sestave eluenta na vhodu v analitično kolono. Kot eluent smo uporabili acetonitril, deionizirano vodo in amonijev acetat v različnih razmerjih. Izbira gradientnega načina kromatografije je bila posledica dejstva, da v pogojih izokratskega načina eluiranja (vključno z uporabo različnih koncentracij acetonitrila) ni bilo mogoče dobiti vrha preskusne snovi simetrične oblike z retencijski čas, primeren za analizo. Glede na študijo je bil optimalen naslednji način dovajanja eluenta: od 0 do 4 min je bila koncentracija acetonitrila 1 %; od 4 do 8 minut linearno povečanje koncentracije acetonitrila do 99%; od 8 do 12 minut - izokratski odsek (1% acetonitril). Po zaključku študije smo kromatografsko kolono 5 minut izpirali s 30% raztopino acetonitrila.

Pri uporabi opisanega načina kromatografije za proučevano spojino smo dobili simetričen vrh zadostne intenzivnosti (slika 4).

riž. 4. Kromatogram LHT 7-09 (analitska kolonaAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7µm 2,1x10 mm; gradientna kromatografija)

Analiza dobljenih kromatogramov za raztopine LHT 7-09 različnih koncentracij je pokazala, da je bil retencijski čas (tR) pri teh elucijskih pogojih 11 minut in ni odvisen od koncentracije testirane snovi. V zvezi s tem lahko vrednost retenzijskega časa uporabimo kot dodatno merilo za potrditev avtentičnosti LHT 7-09 v večkomponentnih mešanicah. Omeniti velja, da je mogoče te kromatografske parametre uporabiti za identifikacijo LHT 7-09 ne le z masnim detektorjem, temveč tudi z drugimi detektorji, vključno s fotometričnim.

Za kvantitativno določitev novega derivata tiadiazola je bila izdelana umeritvena krivulja v koncentracijskem območju od 0,397 ng/mL do 397 ng/mL (slika 5).

riž. Sl. 5. Kalibracijski graf za določanje koncentracije LHT 7-09 (vzdolž abscisne osi - koncentracija LHT 7-09 v ng / ml, vzdolž ordinatne osi - površina vrha v impulzih)

Za razvoj umeritvene raztopine so bile uporabljene raztopine LHT 7-09 v koncentracijah 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Odvisnost površine vrha od koncentracije proučevane spojine smo opisali z naslednjo regresijsko enačbo:

y= 8,9e 5 x 0,499 , vrednost regresijskega koeficienta je bila r=0,9936.

Treba je opozoriti, da razvita kalibracijska raztopina omogoča kvantitativno določanje preučevane spojine z visoko natančnostjo v širokem razponu koncentracij, kar omogoča uporabo te metode za oceno kakovosti zdravilne učinkovine in izvajajo farmakokinetične študije.

Tako je bil rezultat študije razvoj metode za identifikacijo in kvantifikacijo novega aminokislinskega derivata tiadiazola z uporabo HPLC-MS/MS.

zaključki

1. HPLC-MS/MS omogoča identifikacijo in kvantifikacijo novega aminokislinskega derivata tiadiazola z visoko natančnostjo.
2. Masovno detekcijo novega derivata tiadiazola LHT 7-09 je treba izvesti v načinu skeniranja pozitivnih ionov (MRM prehod - prekurzorski ion Q1 m/ z 285,2 Da; ioni produkta Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da in m/ z 75,1 Da).
3. Za izolacijo LCT 7-09 iz večkomponentnih zmesi je bila razvita tehnika tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (analitska kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm; eluent acetonitril: deionizirana voda: amonijev acetat; gradientni način).

Bibliografska povezava

Glede na pregled, objavljen v reviji Clinical Biochemist Reviews, se je uporaba tekočinske kromatografije visoke ločljivosti v kombinaciji s tandemsko masno spektrometrijo (HPLC-MS/MS) v kliničnih laboratorijih izjemno povečala v zadnjih 10-12 letih. Avtorji ugotavljajo, da je specifičnost analize HPLC-MS/MS bistveno boljša od imunoloških metod in klasične tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) pri analizi molekul z nizko molekulsko maso in ima bistveno večjo prepustnost kot plinska kromatografija-masna spektrometrija ( GC-MS). Priljubljenost te metode v rutinskih kliničnih analizah je trenutno razložena z edinstvenimi zmogljivostmi metode.

Glavne prednosti metode HPLC-MS/MS so:
• Sposobnost natančnega kvantificiranja majhnih molekul;
• Hkratna analiza več ciljnih spojin;
• Edinstvena specifičnost;
• Visoka hitrost analize.

AT Zadnja leta veliko pozornosti namenjamo času analize in posledično povečanju produktivnosti laboratorija. Znatno skrajšanje časa analize je bilo omogočeno z uporabo kratkih analitskih kolon za HPLC/MS/MS, hkrati pa se je dramatično povečala specifičnost analize. Uporaba ionizacije pri atmosferskem tlaku (API), tandemskega trojnega kvadrupolnega masnega spektrometra in napredne tekočinske kromatografije visoke ločljivosti ter povezanih metod priprave vzorcev je LC/MS/MS postavila v ospredje sodobnih analiznih metod za klinične raziskave.

Glavna področja uporabe HPLC/MS/MS v klinični medicini:
• Pridobivanje popolnega profila presnove steroidov (steroidne plošče), purinov in pirimidinov ter drugih spojin,
  presejanje novorojenčkov za prirojene presnovne napake (odkrivanje več deset bolezni v eni analizi);
• Terapevtsko spremljanje zdravila- imunosupresivi, antikonvulzivi, protiretrovirusna zdravila, antikoagulanti in kateri koli drugi - ne glede na razpoložljivost kompletov proizvajalca. Ni vam treba kupovati dragih kompletov za vsako snov – lahko razvijete lastne metode;
• Klinična toksikologija - analiza več kot 500 narkotičnih spojin in njihovih metabolitov v eni analizi, brez potrditvene analize
  proteomika in metabolomika.

Poleg tega se HPLC-MSMS uporablja za presejanje oligosaharida, sulfatida, dolge verige v urinu. maščobne kisline, dolga veriga žolčne kisline, metilmalonska kislina, raziskave porfirije, presejanje bolnikov z motnjami presnove purinov in pirimidinov.

Primeri uporabe tekočinske kromatografije
v kombinaciji s tandemsko masno spektrometrijo v kliničnih testih.

Pregled novorojenčka: Prvi primer množične uporabe HPLC-MS/MS v klinična diagnostika je bil pregled prirojenih presnovnih napak pri novorojenčkih. Trenutno v razvite države to je rutinska metoda in pokriva več kot 30 različnih bolezni, vključno z acidemijo, aminoacidopatijo, napakami v oksidaciji maščobnih kislin. Posebej velja omeniti raziskave prirojenih napak, ki lahko povzročijo resne težave, če jih ne obravnavamo takoj (npr. povečano srce ali jetra ali možganski edem). Prednost uporabe HPLC-MS/MS za presejanje novorojenčkov je zmožnost hkratne analize vseh aminokislin in acilkarnitinov s hitro, poceni in zelo specifično metodo.

Terapevtsko spremljanje zdravil: Razvoj in uvedba imunosupresiva sirolimusa (rapamicina) za preprečevanje zavrnitve organa po presaditvi je bil eden od glavnih gonil za uvedbo HPLC-MS/MS v kliničnih laboratorijih. Sodobna metoda HPLC-MS/MS omogoča sočasno določanje takrolimusa, sirolimusa, ciklosporina, everolimusa in mikofenojske kisline.

HPLC-MS/MS se uporablja tudi za analizo citotoksičnih, protiretrovirusnih zdravil, tricikličnih antidepresivov, antikonvulzivov in drugih zdravil, ki zahtevajo individualno odmerjanje.

Metoda HPLC-MSMS omogoča ločevanje in kvantificiranje R- in S-enantiomerov varfarina v koncentracijskem območju 0,1-500 ng/ml.

Zdravila in zdravila proti bolečinam: HPLC-MS/MS se pogosto uporablja za analizo teh spojin zaradi enostavne priprave vzorcev in kratkega časa analize. Metoda se trenutno uporablja v kliničnih laboratorijih za odkrivanje prisotnosti širokega spektra zdravil. Edinstvena specifičnost in občutljivost metode omogoča hkratno analizo več kot 500 spojin različnih razredov v enem vzorcu z minimalno pripravo vzorca. Torej, v primeru analize urina zadostuje preprosto redčenje vzorca za 50-100 krat. Pri analizi las je namesto šopa 100-200 las dovolj en sam las za zanesljivo prepoznavanje dejstev uporabe drog.

Endokrinologija in analiza steroidov: HPLC-MS/MS se pogosto uporablja v številnih endokrinoloških laboratorijih za analizo steroidov – testosterona, kortizola, aldesterona, progesterona, estriola in mnogih drugih.

Vedno več laboratorijev začenja uporabljati HPLC-MS/MS za določanje ravni vitamina D3 in D2 v krvi.

I. Opredelitev steroidov (steroidni profil).

Laboratoriji v bolnišnicah in klinikah imajo zdaj možnost izvajanja hkratnega določanja več steroidov s HPLC/MS/MS. Ni potrebe po velikem volumnu vzorca, kar je še posebej pomembno pri analizi vzorcev otrok.

Primeri, v katerih je priporočljivo opraviti določanje več (profiliranje) steroidov:
• Prirojena hiperplazija nadledvične žleze (CAH) je prirojena okvara v biosintezi steroidov. To je dedna skupina bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja encimov skorje nadledvične žleze, kar povzroči zmanjšanje proizvodnje kortizola. Za zanesljivo diagnozo SAN je priporočljivo določiti kortizol, androstendion in 17-hidroksiprogesteron. HPLC/MS/MS omogoča natančno kvantifikacijo vseh treh steroidov v eni sami analizi s 100 % zanesljivostjo.
• Za rutinsko presejanje novorojenčkov z uporabo imunskih testov je značilna visoka stopnja pozitivnih in lažno negativnih rezultatov dojk. HPLC/MS/MS določanje ne le kortizola, ampak tudi aldosterona in 11-deoksikortizola omogoča razlikovanje med primarno in sekundarno adrenalno insuficienco.
• HPLC/MS/MS omogoča določanje steroidov pri prostatitisu in sindromu kronične medenične bolečine.
• HPLC-MS/MS omogoča določitev steroidnega profila in odkrivanje vzrokov za prezgodnjo puberteto nadledvične žleze pri majhnih otrocih. Ugotovljeno je bilo, da so bile koncentracije testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) in njegovega sulfata pri teh otrocih nekoliko višje kot pri starejših kontrolnih otrocih.
• Serum aktivnih kadilcev, pasivnih kadilcev in nekadilcev se analizira na prisotnost 15 steroidnih hormonov in ščitničnih hormonov, da se razišče povezava med bolniki, izpostavljenimi dimu, in koncentracijami hormonov.
• HPLC/MS/MS se uporablja za profiliranje nekaterih ženskih steroidnih hormonov v urinu.
• Z uporabo HPLC/MS/MS smo ovrednotili koncentracije nevroaktivnih hormonov, da bi preprečili diabetično nevropatijo.

II. Določanje ščitničnih hormonov

Rutinske metode za določanje ščitničnih hormonov običajno temeljijo na radioimunskem testu, ki je drag in zazna le T3 in T4, kar lahko omeji zmožnost določanja in popolnega uravnavanja delovanja ščitnice.

• Trenutno z uporabo HPLC-MSMS sočasna analiza petih ščitničnih hormonov v vzorcih krvnega seruma, vključno s tiroksinom (T4), 3,3',5-trijodtironinom (T3), 3,3',5'- (rT3), 3, 3'-dijodtironin (3,3'-T2) in 3,5-dijodtironin (3,5-T2) v koncentracijskem območju 1-500 ng/ml.
• Metoda HPLC/MS/MS se uporablja tudi za analizo sestave hormonov pri bolnikih, ki so bili podvrženi tiroidektomiji. Po operaciji se določijo vrednosti tiroksina (T4), trijodtironina (T3), prostega T4 in ščitničnega stimulirajočega hormona (TSH). Ugotovljeno je bilo, da je HPLC/MS/MS odličen način za ugotavljanje razmerja med TSH in koncentracijami ščitničnih hormonov.
• Z metodo HPLC/MS/MS smo določili tiroksin (T4) v slini in človeškem krvnem serumu. Metodo odlikuje visoka ponovljivost, natančnost in meja detekcije 25 pg/ml. Študije so pokazale, da obstaja diagnostična povezava med koncentracijami T4 v slini med eutiroidnimi osebami in bolniki z Gravesovo boleznijo.

Metoda HPLC/MS/MS ima zdaj občutljivost, specifičnost in natančnost, ki je potrebna za zanesljivo odkrivanje vseh steroidov v bioloških tekočinah in tako povečuje diagnostične zmogljivosti, zlasti v primeru nizov steroidov.

III. Določanje 25-hidroksivitamina D s HPLC/MS/MS

25-hidroksi vitamin D (25OD) je glavna oblika vitamina D v obtoku in predhodnik njegove aktivne oblike. (1,25-dioksivitamin D). Zaradi njegove dolge razpolovne dobe je določitev 25OD pomembna za ugotavljanje stanja vitamina D v telesu bolnika. Vitamin D obstaja v dveh oblikah: vitamin D3 (holekalciferol) in vitamin D2 (ergokalciferol). Obe obliki se presnovita v svoji obliki 25OD. Zelo velik pomen za diagnostiko ima na voljo analizne metode, ki lahko z visoko natančnostjo določijo obe obliki vitamina in omogočajo spremljanje bolnikov z motnjami vitamina D. Dosedanje metode niso omogočale ločenega določanja vitamina D2 in D3. Poleg tega je pri visokih koncentracijah vitamina D2 zaznavna količina D3 podcenjena. Druga pomanjkljivost je uporaba radioaktivnih izotopov. Uporaba metode HPLC/MS/MS je omogočila ne le izogibanje uporabi radioaktivnih izotopov, temveč tudi izvedbo ločenega določanja obeh aktivne oblike vitamin A.

Metoda se uporablja za naslednje bolnike:
1. Če sumite na nizko vsebnost vitamina D v telesu;
2. Če sumite na nepojasnjen toksični učinek;
3. Pri pregledu bolnikov, ki se zdravijo zaradi nizke vsebnosti vitamina D;
4. Uporaba HPLC/MS/MS je omogočila ločeno določanje obeh oblik med spremljanjem bolnika.

IV. Določanje imunosupresivov s HPLC/MS/MS

Po presaditvi organa je treba vse življenje jemati imunosupresive, da preprečimo zavrnitev. Z zelo ozkim terapevtskim oknom in visoko toksičnostjo potrebujejo imunosupresivi individualne odmerke, da dosežejo največji učinek. Zato je ključnega pomena spremljanje glavnih imunosupresivov: ciklosporina A, takrolimusa, sirolimusa in everolimusa, da prilagodimo odmerek zdravil za vsakega posameznega bolnika glede na koncentracijo zdravila v krvi.

Za spremljanje teh zdravil se še vedno uporabljajo imunski testi, vendar so te metode drage, njihova specifičnost, natančnost in ponovljivost pa omejena. Bolniki so umrli zaradi nepravilnega odmerjanja imunosupresivov na podlagi rezultatov, pridobljenih z imunološkimi metodami. Trenutno imunske teste v kliničnih laboratorijih nadomešča HPLC/MS/MS. Tako na primer na kliniki Univerze v Münchnu dnevno analizirajo približno 70 vzorcev na vsebnost sirolimusa in ciklosporina A s sistemom HPLC/MS/MS. Vso pripravo vzorcev in kontrolo instrumentov izvaja ena oseba. Laboratorij prehaja tudi na analizo takrolimusa po tej metodi.

• Opisana je uporaba HPLC/MS/MS za rutinsko sočasno določanje takrolimusa, sirolimusa, askomicina, demetoksisirolimusa, ciklosporina A in ciklosporina G v krvi. Območje, ki ga določa koncentracija, je 1,0 - 80,0 ng / ml. Za ciklosporin 25 - 2000 ng / ml. V letu so v laboratoriju analizirali več kot 50.000 vzorcev.
• Ker je bilo ugotovljeno, da sočasna uporaba takrolimusa in sirolimusa daje pozitiven terapevtski učinek, je bila razvita preprosta in učinkovita HPLC/MS/MS metoda za njuno ločeno določanje v krvi za klinične teste. Analiza enega vzorca traja 2,5 minute z natančnostjo 2,46% - 7,04% za takrolimus in 5,22% - 8,30% za sirolimus za celotno analitično krivuljo. Spodnja meja detekcije takrolimusa je 0,52 ng/ml, sirolimusa pa 0,47 ng/ml.

V. Določanje homocisteina s HPLC/MS/MS

Homocistein je zanimiv za bolezni srca in ožilja(trombembolija, bolezni srca, ateroskleroza) in druga klinična stanja (depresija, Alzheimerjeva bolezen, osteoporoza, zapleti v nosečnosti itd.). Obstoječe metode za analizo homocisteina, vključno z imunskim testom, so drage. Hitra HPLC/MS/MS metoda za analizo homocisteina je bila razvita za rutinsko klinično uporabo pri analizi velikega števila vzorcev. Ionizacija je bila izvedena z metodo elektrospreja. Metoda je ponovljiva, zelo specifična in natančna. Prednosti metode sta tudi nizka cena reagentov in enostavna priprava vzorca. Dnevno je možno analizirati 500 ali več vzorcev.

Zaključek

Opozoriti je treba, da kljub temu, da se trenutno uporabljajo znatno izboljšane metode imunoloških testov, zaradi temeljnih tehničnih omejitev ta metoda nikoli ne bo imela primerljive natančnosti in specifičnosti za ciljno snov v primerjavi s HPLC-MSMS, zlasti v prisotnosti metabolitov. To ne vodi samo v nizko natančnost metode ELISA in visok odstotek lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov, temveč tudi ne omogoča primerjave rezultatov, pridobljenih na različnih kliničnih oddelkih z metodo ELISA. Uporaba HPLC-MS/MS odpravlja to pomanjkljivost, saj omogoča visoko specifično, natančno in hitro analizo velikega števila vzorcev z visoko zanesljivostjo v prisotnosti presnovkov in odsotnosti motenj zaradi sočasnih in endogenih substanc v plazmi in krvi bolniki.

Kljub navideznim visokim stroškom kompleksa instrumentov, kot kaže svetovna praksa, se ta kompleks s pravilnim delovanjem izplača v 1-2 letih. To je predvsem posledica nizkih stroškov ene analize zaradi hkratne analize več deset in sto spojin in odsotnosti potrebe po nakupu dragih diagnostičnih kompletov. Poleg tega ima laboratorij možnost, da samostojno razvije vse potrebne metode analize in ni odvisen od proizvajalca kompletov.

Izbira pravilne konfiguracije instrumentov

obstaja veliko število različne metode masna spektrometrija in vrste masnih spektrometrov, zasnovanih za reševanje najrazličnejših problemov - od strukturne identifikacije kompleksnih beljakovinskih makromolekul, ki tehtajo na stotine tisoč daltonov, do rutinske visoko zmogljive kvantitativne analize majhnih molekul.

Za uspešno reševanje naloge je eden glavnih pogojev izbira prave vrste opreme. Ni univerzalnega instrumenta, ki bi rešil celotno paleto analitičnih problemov. Tako naprava, namenjena reševanju problema identifikacije mikroorganizmov, ni sposobna izvajati kvantitativne analize majhnih molekul. In obratno. Dejstvo je, da je kljub skupnemu imenu povsem razne aparate delujejo na različnih fizikalnih principih. V prvem primeru je to masni spektrometer s časom preleta z laserskim ionizacijskim virom - MALDI-TOF, v drugem primeru pa trojni kvadrupol z elektrosprejno ionizacijo - HPLC-MSMS.

Drugi najpomembnejši parameter je izbira pravilne konfiguracije sistema. Obstaja več velikih proizvajalcev opreme za masno spektrometrijo. Naprave vsakega proizvajalca nimajo le prednosti, ampak tudi slabosti, o katerih običajno raje zamolčijo. Vsak proizvajalec proizvaja svojo linijo naprav. Stroški enega analitičnega kompleksa se gibljejo od 100.000 $ do 1.000.000 $ ali več. Izbira najboljšega proizvajalca in pravilne konfiguracije opreme ne bo le prihranila znatnih finančnih sredstev, ampak tudi učinkoviteje rešila problem. Na žalost je veliko primerov, ko je bila oprema laboratorija izvedena brez upoštevanja teh dejavnikov. Rezultat je neuporabna oprema, zapravljen denar.

Tretji dejavnik, ki določa uspešno delovanje laboratorija, so kadri. Masni spektrometri zahtevajo visoko usposobljeno osebje. Na žalost nobena univerza v Rusiji nima tečaja o sodobni praktični masni spektrometriji, zlasti v zvezi s kliničnimi aplikacijami, zato je treba naloge usposabljanja osebja vsakega laboratorija reševati samostojno. Seveda 2-3 dni seznanitvenega usposabljanja, ki ga izvaja proizvajalec po lansiranju opreme, absolutno ni dovolj za razumevanje osnov metode in pridobivanje veščin pri delu z napravo.

Četrti dejavnik je pomanjkanje že pripravljenih metod analize. Vsak laboratorij ima svoje prednostne naloge, za rešitev katerih je potrebno razviti lastne metode. To lahko stori oseba, ki ima vsaj 2-3 leta izkušenj z delom na napravi. Proizvajalci včasih ponudijo eno ali dve splošni metodi priporočljive narave, vendar ju ne prilagodijo specifičnim laboratorijskim nalogam.

AT BioPharmExpert LLC so strokovnjaki z dolgoletnimi izkušnjami v različne vrste masni spektrometri, kot tudi razvoj metod in formulacija visoko zmogljivih analiz. Zato nudimo naslednje storitve:

1. Izbira optimalne konfiguracije instrumenta za specifične naloge kupca.
2. Nakup, dobava in zagon opreme vodilnih proizvajalcev tandemskih masnih spektrometrov Postopno usposabljanje osebja v enem letu od datuma zagona opreme.
3. Nabor že pripravljenih metod in baz podatkov za reševanje osnovnih kliničnih problemov.
4. Razvoj metod analize in reševanje specifičnih nalog naročnika v njegovem laboratoriju z vključevanjem njegovega osebja.
5. Metodološka podpora v vseh fazah dela.